研究背景
我们先前进行的三期随机对照临床研究（randomized controlled trial, RCT）[1]比较了化疗（mFOLFOX6或FOLFIRI）联合西妥昔单抗和单纯化疗治疗KRAS exon 2 野生型不可切除的结直肠癌肝转移的效果。结果显示化疗联合西妥昔单抗可以显著提高肝转移灶转化切除率（主要研究终点），客观反应率（objective response rate , ORR），无进展生存期（progression-free survival, PFS）以及总生存期（overall survival, OS）。与我们的结果相类似，三期CRYSTAL [2, 3]研究显示FOLFIRI联合西妥昔单抗一线治疗KRAS exon 2 野生型不可切除的结直肠癌肝转移患者可以显著提高ORR，PFS以及OS。另外，二期OPUS [5]研究选择了FOLFOX化疗方案，结果同样显示，与西妥昔单抗联合后可以显著提高ORR和PFS。
上述研究均显示KRAS exon 2野生型患者可从西妥昔单抗的治疗中明显获益，但这其中仍有约半数的患者多西妥昔单抗存在原发耐药的现象。因此，目前急需KRAS exon 2以外的生物标记物来帮助我们更加准确地选择对西妥昔单抗敏感的患者，以提高患者获益同时规避治疗带来的风险。最近，越来越多的证据表明携带RAS基因稀有突变（KRAS codon59, 61, 117, 146和NRAS codon12, 13, 59, 61,117, 146）的患者可能对西妥昔单抗耐药[4, 6]。同时，EGFR通路中另外两个重要基因BRAF和PI3KCA也得到了一定的关注，但是仍未得到统一的结果[3, 4, 8-11]。
我们在前期三期随机对照临床研究的基础上开展了此回顾性研究，以评估稀有RAS突变以及BRAF和PI3KCA突变对于西妥昔单抗疗效的影响。
材料与方法
本研究中的所有患者均来自我们先前得三期随机对照临床研究（NCT01564810）[1]。原RCT首要研究终点为肝转移灶转化切除率。患者被随机分配至靶向组（化疗+靶向治疗）或化疗（单纯化疗）组。当患者转化为肝转移可切除，出现疾病进展或者无法耐受治疗毒副作用时治疗终止。自化疗4个周期后开始对患者进行定期评估，每2个周期一次，最多评估至第12个周期。肝转移灶状态由多学科团队（multidisciplinary treatment team, MDT）依据RESCIT标准评估确定[12, 13]。患者入组时间自2008年6月至2012年12月。
本研究收集了所有数量足够，质量合格的原发灶石蜡标本，抽提DNA后进行二代测序，测序平台为PGM（Ion Torrent Personal Genome Machine）。测序位点包括KRAS exon 3(codon 59 和 61) 和 exon 4 (codon 117 和 146); NRAS exon 2 (codon 12 和 13), exon 3 (codon59 和 61) 和 exon 4 (codon 117 和 146); BRAF exon 15 (codon 600); 和 PI3KCA exon 9 (codon542, 545 和 546) 和exon 20 (codon 1047 和 1049)。所有位点均来自已有文献报道[4, 6, 10, 11]。
统计方案在测序进行前已经拟定完成。我们首先评估所有进行二代测序的患者的疗效，随后评估RAS野生型和RAS突变型的疗效，并进行交互作用分析进一步判断稀有RAS突变的预测作用。在RAS野生型的人群中，我们再根据BRAF和PI3KCA的状态进行亚组分析。
研究结果
突变情况
原RCT入组138名患者，其中106（76.8%）名在本研究中进行了二代测序。13（12.3%）名患者为稀有RAS突变，14（13.2%）名为BRAF突变，11（10.4%）名为PI3KCA突变。
疗效分析-RAS
在所有完成测序的人群（N=106）中，靶向组中各项预后指标显著提高（表 1, 图 1A, 图 2A）。在RAS野生型亚组（N=93）中，靶向组各项预后指标也显著提高（表 1 图 1B, 图 2B），而且HR和OR值提示其效果较测序总人群更好。根据临床因素的亚组分析仍能观察到显著的疗效提高（图 3）。在RAS突变型亚组（N=13）中，靶向组和化疗组效果相仿（表 1 图 1C, 图 2C）。RAS野生型亚组和RAS突变型亚组在PFS（P=0.032）和OS（P=0.016）上表现出显著的交互作用，而在ORR（P=0.108）上没有。
图1 无疾病进展期的K-M生存曲线
（A）所有测序人群
（B）RAS野生型亚组
（C）RAS突变型亚组
图2 总生存期的K-M生存曲线
（A）所有测序人群
（B）RAS野生型亚组
（C）RAS突变型亚组
图3 根据临床因素的亚组分析
（A）无疾病进展期
（B）总生存期
疗效分析-BRAF和PI3KCA
RAS/BRAF野生型亚组，RAS/PI3KCA野生型亚组以及RAS/BRAF/PI3KCA三野生型亚组均与RAS野生型亚组间没有明显的疗效差异（表2）。
讨论
本研究的首要研究目标是评估稀有RAS突变对于西妥昔单抗疗效的影响。在RAS野生型亚组（N=93）中，靶向组各项预后指标显著提高，且均优于测序总人群（N=106）。而在RAS突变型亚组（N=13）中，靶向组和化疗组效果相仿。我们的结果和CRYSTAL [4]研究以及OPUS [6]研究相类似，均提示稀有RAS突变对爱必妥疗效有预测作用。同时，由于本研究样本量有限，在分析和理解结果时仍需谨慎。综合上述各项研究的结果来看，在实际临床应用中，选择西妥昔单抗治疗时应该考虑稀有RAS位点的突变情况。
全部RAS突变大约仅能解释一半的西妥昔单抗原发耐药现象[7]。从基因的角度来说，剩下的耐药现象来自于EGFR通路相关的其他基因突变。BRAF和PI3KCA就是其中两个可能性较高的候选基因。我们的数据显示两者对于西妥昔单抗的疗效均无预测作用。既往的研究也难以得出统一的结论[3, 4, 8-11]。我们还尝试了联合BRAF和PI3KCA进行分析，RAS/BRAF/PI3KCA三野生型亚组与RAS野生型亚组间仍没有观察到明显的疗效差异。
本研究选用的二代测序平台为PGM[14]，其基本原理是检测DNA合成是的pH值变化。目前已经有诸多研究表明PGM测序，与Sanger测序相比，有相近的准确度和相似或更低的费用[15-17]。在不远的将来，二代测序也许会替代Sanger测序成为金标准，PGM测序将是一个很好地选择。
总的来说，在筛选掉稀有RAS突变的人群后，RAS野生型人群的疗效有了进一步的提高，这支持我们在临床应用中选择西妥昔单抗前进行全RAS检测以期给予患者更加准确和合适的治疗。同时，在寻找其他西妥昔单抗预测标志物上仍需更多的努力。
参考文献:
1.Le-Chi Ye, Tian-Shu Liu,Jianmin Xu, et al. Randomized controlled trial of cetuximab plus chemotherapyfor patients with KRAS wild-type unresectable colorectal liver-limitedmetastases. J Clin Oncol 2013;31:1931-8.
2.Van Cutsem E, Kohne CH, HitreE, et al. Cetuximab and chemotherapy as initial treatment for metastaticcolorectal cancer. N Engl J Med 2009;360:1408-17.
3.Van Cutsem E, Kohne CH, Lang I,et al. Cetuximab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin as first-linetreatment for metastatic colorectal cancer: Updated analysis of overallsurvival according to tumor KRAS and BRAF mutation status. J Clin Oncol 2011;29:2011-2019.
4.Van Cutsem E, Lenz HJ, Köhne CH,et al. Fluorouracil, leucovorin, and irinotecan plus cetuximab treatment andRAS mutations in colorectal cancer. J Clin Oncol. 2015; 33(7):692-700.
5.Bokemeyer C, Bondarenko I,Makhson A, et al. Fluorouracil,leucovorin, and oxaliplatin with and withoutcetuximab in the first-line treatment of metastatic colorectal cancer. J ClinOncol 2009;27:663-71.
6.Bokemeyer C, Bondarenko I,Hartmann JT, et al. Efficacy according to biomarker status of cetuximab plusFOLFOX-4 as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: the OPUSstudy. Ann Oncol 2011;22:1535-46.
7.Misale S, Di Nicolantonio F,Sartore-Bianchi A, et al. Resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer:from heterogeneity to convergent evolution. Cancer Discov. 2014;4(11):1269-80.
8.Tol J, Nagtegaal ID, Punt CJ.BRAF mutation in metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 2009;361:98–99.
9.Laurent-Puig P, Cayre A,Manceau G, et al. Analysis of PTEN, BRAF, and EGFR status in determining benefitfrom cetuximab therapy in wild-type KRAS metastatic colon cancer. J Clin Oncol2009;27:5924–30.
10.Karapetis CS, Jonker D,Daneshmand M, et al. PIK3CA, BRAF, and PTEN status and benefit from cetuximabin the treatment of advanced colorectal cancer—results from NCIC CTG/AGITGCO.17. Clin Cancer Res 2014;20:744–53.
11.De Roock W, Claes B, BernasconiD, et al. Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy ofcetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectalcancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 2010 ;11(8):753-62.
12.Therasse P, Arbuck SG,Eisenhauer EA, et al. New guidelines to evaluate the response to treatment insolid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer,National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute ofCanada. J Natl Cancer Inst. 2000;92(3):205-16.
13.Eisenhauer EA, Therasse P,Bogaerts J, et al. New response evaluation criteria in solid tumours: revisedRECIST guideline (version 1.1). Eur J Cancer. 2009;45(2):228-47.
14.Flusberg BA, Webster DR, LeeJH, et al. Direct detection of DNA methylation during single-molecule,real-time sequencing. Nature Methods. 2010;7(6):461-5.
15.Sikkema-Raddatz B, JohanssonLF, de Boer EN, et al. Targeted next-generation sequencing can replace Sangersequencing in clinical diagnostics. Hum Mutat. 2013 Jul;34(7):1035-42.
16.Malapelle U, Vigliar E,Sgariglia R, et al. Ion Torrent next-generation sequencing for routineidentification of clinically relevant mutations in colorectal cancer patients.J Clin Pathol. 2015；68(1):64-8.
17.Zhang L, Chen L, Sah S, et al.Profiling cancer gene mutations in clinical formalin-fixed, paraffin-embeddedcolorectal tumor specimens using targeted next-generation sequencing. Oncologist2014;19:336-43.
附：
本研究由复旦大学附属中山医院普外科结直肠癌专业组发起，主要完成人为许剑民教授。前期已经完成的III期随机对照临床研究比较了化疗（mFOLFOX6或FOLFIRI）联合西妥昔单抗和单纯化疗治疗KRAS exon 2 野生型不可切除的结直肠癌肝转移的效果，其研究成果在2012年ESMO大会上进行大会交流，并发表在权威杂志《Journal of Clinical Oncology》(IF=17.9)上。本研究是在上述RCT基础上的继续探索，以期找到更多西妥昔单抗的预测靶标，最终服务临床，造福患者。
许剑民教授，复旦大学附属中山医院普外科副主任，中国医师协会外科分会结直肠外科专委会常委兼副秘书长，上海市优秀学术带头人，世界华人消化杂志《WJG》编委。长期从事结直肠癌肝转移的临床诊疗和机制研究。其带领的MDT团队每年为300余名晚期结直肠癌患者制定诊疗方案。同时还负责完成了国家自然科学基金面上项目2项、国家卫生部重点学科项目2项、上海市科委重大课题1项等多项科研项目。
苏公网安备32059002004080号
