整理：月下荷花
来源：肿瘤资讯
微卫星不稳定性是结直肠癌中一种较为特殊的表型，它对结直肠癌的生物学行为、治疗等方面有着诸多影响，下面就来看看这些方面的研究进展。
结直肠癌是西方国家的主要公共健康问题，虽然传统临床病理分期对结果预测仍有很大作用，但CRC在预后和治疗反应上异质很大，这可能与CRC发病的遗传学改变有关：85%的CRCs由染色体改变驱动，还有15%由DNA MMR系统功能缺陷驱动。
MSI（微卫星不稳定性）是林奇综合征（LS）的分子标志，通常具有一个MMR基因的一个胚系突变。大部分MSI CRC病例为散发，多由hMLH1表观失活所致。II–III期的MSI CRCs为15%，IV期为4–5%。意大利的Gelsomino教授在Cancer Treat Rev杂志上发表综述，总结了MSI CRCs的临床病理特征，MSI在早期和转移性疾病中的预后和预测作用，以及对新药治疗的指导作用。
微卫星不稳定性：定义
MMR对校正DNA复制过程中发生的错误配对非常重要，该修复系统主要包括4个蛋白，MLH、MSH2、MSH6和PMS2。微卫星是包含1-6个碱基的重复DNA序列，分布于整个基因组，微卫星对复制错误易感，正常时可由MMR系统修复，缺失一个MMR蛋白功能时导致MMR系统缺陷，致微卫星复制错误累积，造成遗传不稳定性。
MSI发生在关键细胞功能与途径的编码区时具有致癌潜能，可以通过PCR扩增特异的微卫星标志或是免疫组化检测MMR蛋白缺失来发现MSI。LS时MSI通常与一个MMR基因胚系突变有关（多为MLH1或MSH2），而散发MSI CRCs通常是由hMLH1启动子甲基化表观失活所致。
林奇综合征
LS是最常见的遗传性CRC，是高度不完全外显性常染色体疾病，特征是早期发作的结直肠癌和子宫内膜癌，某些结肠外癌症发生风险增加，包括其它部位的胃肠道肿瘤、泌尿道系统肿瘤以及女性生殖系统肿瘤，女性发生CRC风险52.2%，男性68.7%，中位诊断年龄61.2岁。
Amsterdam和Bethesda标准用于鉴别可能为L S的患者以进一步行遗传学检查，如表1和2所示。现在许多指南建议采用二种方法排除LS：一种普遍适用，每个CRC患者均进行检测，另一种是＜70岁诊断CRC患者进行检测以及≥70岁、但满足Bethesda标准患者进行检测，超过1/4的LS患者漏诊（图1）。
表1 修订后Bethesda关于LS相关CRC指南
表2 Amsterdam II标准
图1 林奇综合征诊断流程
免疫组化与遗传学检查结果的吻合性很好，新专家共识推荐使用一组5个单核苷酸重复序列（BAT-25、BAT-26、NR21、NR24和NR27），其特征是不同个体间的单核苷酸重复序列数量和大小恒定。根据MSI多少，CRCs分成高度微卫星不稳定性（MSI-H）、低度微卫星不稳定性（MSI-L）。MSI-H表型是5个标志中至少有2个不稳定标志，而多数散发CRCs为微卫星稳定性（MSS），缺少MSI特征。
免疫组化方法分析时要注意MMR蛋白PMS2和MSH6分别与MLH1和MSH2协同，其表达与否非常依赖与伴侣蛋白的结合情况，因此缺失MSH2表达时经常也伴有MSH6表达缺失，此时高度提示MSH2胚系突变。同理MLH1表达缺失时也常伴有PMS2表达缺失，此时既可以是MLH1胚系突变，也可以是MLH1基因启动子获得性过度甲基化所致。MSH6和PMS2的胚系突变通常是单独的MSH6和PMS2蛋白表达缺失。
临床病理特征
从临床上看，MSI-H CRCs患者较年轻，多发右半结肠，多源于无蒂锯齿状腺瘤，分期较早，多为II期。与LS相反，散发CRCs患者年龄相对较大，常为女性和吸烟者。
组织学上的一些特征也提示MSI状态，如大量产生粘蛋白并在胞外堆积，或印戒细胞分化，可与胞外粘蛋白同时存在。有时MSI-H CRCs看起来分化很差，有时表现为少见的组织类型髓样癌，细胞呈片状分布、核有空泡且胞浆嗜酸染色。
MSI CRCs肿瘤内有淋巴细胞浸润，甚至类似克隆病样反应，这是因为缺少MMR系统导致移框突变，产生新抗原，可被细胞毒T细胞（CTL）识别。肿瘤浸润淋巴细胞可分为基质浸润淋巴细胞（SIL）和肿瘤细胞内浸润淋巴细胞（ITCIL），后者常突破肿瘤细胞基底膜。
MSI-H CRCs肿瘤中ITCIL明显浸润，主要是抗原限制性细胞毒T淋巴细胞（CD8+），不论是LS还是散发MSI-H CRCs均如此。Tougeron研究显示移框突变数量以及移框突变是否发生于特殊靶基因（ASTE1/HT001、HNF1A和TCF7L2）中与浸润的CTL数量相关。新抗原由抗原递呈细胞（APC）递呈至CD4+ T细胞，后者分泌细胞因子增加CTL活性。
从分子角度看，当二个原癌基因发生不同突变时应当怀疑MSI-H。BRAF和KRAS是二个突变互相排斥的原癌基因，分别编码丝氨酸/苏氨酸激酶，刺激RAS-RAF-MEK-ERK途径。BRAF V600E突变可排除LS，常发生于散发MSI CRCs，在LS相关CRCs中少见，除非是PMS2胚系突变病例。KRAS突变与MSI-H负相关。Stadler研究证实根据突变负荷能区分dMMR和pMMR，同时NGS还可明确RAS、BRAF和其它基因的突变状态。
MSI对早期和转移性结直肠癌的预后作用
MSI-H CRCs的临床特征显著，预后较好，一项meta分析评估了1277 例MSI-H的I–IV CRC患者，研究发现无论是早期还是进展期疾病，MSI皆有良好预后作用，减少死亡风险35%。
Guastadisegni的meta分析证实了MSI与良好预后间的关系，尤其是OS、DSS和DFS；后续的临床研究证实dMMR肿瘤复发率明显低于pMMR肿瘤；另一项回顾性分析显示对于I–III期MSI-H CRCs，肠梗阻、T4分期和血管浸润是不良PFS的预测因子，可用于指导辅助化疗。
BRAF突变状态与MMR在早期疾病中的作用仍有争议。PETACC3研究的post-hoc分析显示BRAF突变对OS的影响只局限于MSI-L和MSS肿瘤，对MSI-H肿瘤没有预后作用，这一点在Samowitz的研究中进一步证实。Lochhead的研究进一步表明MSI-H/BRAFWT患者预后最后，有BRAF突变者死亡率最高，CALGB 89803研究进一步证实：MSI-H/BRAFMT患者中MSI的预后作用被BRAF突变中和，导致与MSS/BRAFWT患者生存时间相同，换言之MSI-H/BRAFWT患者生存更长，MSS/BRAFWT或MSI-H/BRAFMT生存为中等，而MSS/BRAFMT生存最差。
上述证据显示早期疾病具有BRAF突变时对MSS和MSI-L CRC有不良影响，而对MSI-H肿瘤则中和了MSI的良好预后作用。转移性疾病中MMR作用的数据较少，因为IV期MSI发生率较低。
复发CRCs研究显示MSI-H肿瘤的OS较差，虽然MSI-H肿瘤的复发率较低，且多为局部和腹腔复发，但较少可能获得治愈性切除，也不获益于转化治疗，提示这类肿瘤存在内源性化疗耐药。
CAIRO、CAIRO2、COIN和FOCUS研究的荟萃分析证实了这一结果，153例MSI-H转移性肿瘤的中位PFS和OS明显差于pMMR肿瘤。一项回顾性研究显示转移性dMMR CRC患者的结果与pMMR肿瘤相比并无明显改善，不过MSI-H/BRAFWT肿瘤患者的OS优于MSI-H/BRAFMT患者。根据上述数据，转移性CRC中MSI具有不良预后作用，BRAF突变提示结果更差。
辅助和转移性治疗中MSI的预测作用
早期CRC中MSI状态预测化疗有效性的研究很多，结果显示dMMR患者在5-FU化疗中缺少获益。临床前数据显示dMMR状态与5-FU耐药有关；Ribic的荟萃分析显示，II和III期结肠癌患者随机接受5-FU+亚叶酸和单独手术治疗，单独手术的dMMR CRC患者生存更优，化疗患者无获益。上述结果在其它研究中进一步得到证实，尤其是II期dMMR患者甚至总生存因化疗而减少。
QUASAR研究中II期CRC患者接受5-FU＋叶酸化疗与单独手术相比，虽然dMMR患者的复发率是pMMR患者的一半，但是化疗有效性未因MMR状态而有不同。来自ACCENT数据的荟萃分析显示单独手术时，II期dMMR和pMMR CRC患者的复发时间（TTR）和OS存在差异，5-FU辅助化疗会缩小这种差异。
MSI的预测作用在III期CRC患者中也得到证实，Sinicrope的分析中纳入2141例II和III期CRC患者，接受含5-FU化疗，亚组分析显示III期dMMR CRC患者辅助性5-FU化疗5年复发率低于单独手术组。所以辅助性5-FU化疗对预后良好的II期MSI-H CRC似乎影响不大，而III期MSI-H CRC患者应考虑辅助化疗。
3个III期研究建立了奥沙利铂与氟脲嘧啶类联合作为III期CRC的标准辅助治疗。与5-FU相反，临床前研究证实MSI肿瘤对奥沙利铂敏感，但临床数据缺乏。
NSABP C07/08研究中纳入II和III期CRC患者，采用5-FU+叶酸±奥沙利铂和FOLFOX ±贝伐单抗治疗，结果显示dMMR改善复发率，但不能预测奥沙利铂获益。不过MOSAIC研究显示II和III期dMMR CRC中，dMMR是独立预测因子，与LV5FU2组患者相比，无论是DFS还是OS，均是FOLFOX4组患者获益更多。NO147研究则证实dMMR近端肿瘤DFS获益，远端和N2肿瘤无获益，提示MMR的预测作用可能与肿瘤位置和淋巴结状态有关。
AGEO研究中共纳入433例dMMR的II和III期CRCs患者，接受单独手术或手术联合辅助化疗（氟脲嘧啶±奥沙利铂）治疗，含奥沙利铂辅助化疗改善DFS，不过分析显示仅限于III期肿瘤和散发肿瘤。综上所述奥沙利铂似乎能克服氟脲嘧啶单药在dMMR CRCs中的不良作用，不过最大获益可能仅限于某些亚组患者，如III期、近端、N1、散发病例。
最近Dalerba的研究证实CDX-2缺失是II期CRC的一个独特表型，预后差，可能从辅助化疗中获益。MSI-H肿瘤与MSS肿瘤相比，似乎多为CDX-2阴性，二者间的关系需进一步探讨，因为表面看起来是矛盾的，因为MSI提示良好预后，可能对5-FU耐药，而当MSI肿瘤CDX-2阴性表达时预后差且可从辅助化疗中获益。
另一个需重点关注的是MSI在局部进展期直肠癌（LARC）含氟脲嘧啶的新辅助化放疗中的预测作用。De Rosa回顾性分析了62例胚系dMMR直肠癌，证实病理完全缓解率27.6%，生存率也极为良好。明确dMMR直肠癌后不但要进一步进行胚系检测，而且还会影响手术切除程度，几个因素需要考虑，例如是否存在同时性结肠病变，肿瘤高度，临床分期以及是否需要放疗。
与早期疾病相反，很少有研究分析转移性疾病时MMR的预测作用，因为只有4%的IV期CRCs是MSI-H。Guetz的meta分析中共纳入964例患者，91例为MSI-H，化疗反应率无明显增加。这些结果对肝转移潜在可手术治疗的患者最有意义，因为新辅助化疗是根据MMR状态、RAS和BRAF突变状态综合考虑后进行的治疗。
MSI结直肠癌的免疫治疗
MSI-H CRCs肿瘤表现为显著的炎症反症，但癌症细胞也据此发展出免疫逃逸能力。例如除了CD4+和CD8+ T细胞，肿瘤微环境促进Tregs细胞累积，通过分泌TGFβ和IL10将免疫反应向利于癌症细胞方向进行；抑制分子表达上调，如节点抑制剂PD1、PDL1、CTLA4、淋巴细胞活化基因3和IDO以及Tregs，这些因素主要通过消耗TILs来削弱免疫系统的杀瘤作用。
为了克服这种缺陷，I期研究评估了耐药实体瘤的抗PD-1治疗，只有一例MSI的CRC表现为持续完全缓解。Le的II期研究评估了帕姆布罗珠治疗dMMR和pMMR CRC以及具有MMR缺陷的其它肿瘤，研究达到了主要终点，显示dMMR CRCs免疫相关的、RECIST客观反应率40%，疾病控制率90%， 20周时免疫相关PFS率78%。6例散发dMMR CRCs均有客观反应率，3/11例LS CRCs有治疗反应，可能是因为胚系dMMR CRCs较散发者发生移框突变的数量低，也可能是由二种CRC不同的发病机制所致。
目前KEYNOTE-164和KEYNOTE-177研究正在进一步评估帕姆布罗珠在MSI/dMMR CRCs中的作用，CHECKMATE-142研究正在评估纳武单抗单药以及与伊匹利姆玛联合在MSI CRCs中的作用。
结语与展望
虽然LS是最常见的遗传性CRC原因，但临床上对它的认识有很大不足，因此方便易行的检测方法很有必要，利于筛选患者进一步行胚系突变检查，并为患者及其家属提供恰当的治疗。
早期CRC中，MSI是明确的预后因子，尤其是II期疾病，同时也是预测5-FU耐药的标志，不过仍有灰区值得探讨，如高危MSI-H的II期疾病。与II期疾病不同，III期CRC中MSI不影响治疗选择（FOLFOX或XELOX），不过存在一个实际问题：对不适合奥沙利铂治疗的III期MSI-H CRC是否应当给予5-FU或卡培他滨单药治疗？
转移性疾病中，MSI-H肿瘤中活跃的免疫微环境使得患者成为免疫靶向治疗研究中最佳的参试者，不过转移性CRC患者很少为MSI-H。
总之MSI CRC是一组异质性的散发或遗传性疾病，二者可能生物学行为不同。MSI发生率较低，分期不同、不同时代治疗标准不同，因此研究起来比较困难，只有世界范围内的合作才能阐明许多悬而未决的问题。由于免疫治疗获得空前成功，可能会彻底改变转移性MSI-H CRCs的治疗规则，此外新辅助和辅助环境下的免疫治疗临床研究也迫在眉睫。
参考文献：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27838401
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