翻译：陈锦霞a，余平元a；审校：罗聪b
a中国科学院大学附属肿瘤医院-温州医科大学联合培养硕士研究生；b中国科学院大学附属肿瘤医院肝胆胰胃内科
引用此文: Dan-Dan Shen , et al. LSD1 deletion decreases exosomal PD-L1 and restores T-cell response in gastric cancer. Mol Cancer. 2022 Mar 16;21(1):75. doi: 10.1186/s12943-022-01557-1.
摘要
背景
已证明组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）的表达在胃癌（GC）中显著升高，并且可能与GC的增殖和转移有关。据报道，在黑色素瘤和乳腺癌中LSD1通过程序性细胞死亡1配体1（PD-L1）抑制肿瘤免疫。而LSD1在GC免疫微环境中的作用尚不清楚。
方法
通过免疫组织化学（IHC）和蛋白质印迹分析GC患者中LSD1和PD-L1的表达。使用超速离心法从GC细胞的培养基中分离外泌体，并通过透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子跟踪分析（NTA）、蔗糖梯度离心和蛋白质印迹对其进行表征。通过流式细胞术、T细胞杀伤和酶联免疫吸附试验（ELISA）评估外泌体PD-L1在T细胞功能障碍中的作用。
结果
通过体内实验，LSD1敲除(KO)的小鼠前胃癌(MFC)细胞在615小鼠中的生长速度明显慢于T细胞缺陷型BALB/c裸鼠。同时，在GC标本中，LSD1表达与CD8表达呈负相关，与PD-L1表达呈正相关。进一步研究表明，LSD1通过诱导PD-L1在外泌体中的积累来抑制GC微环境中T细胞的反应，而膜PD-L1在GC细胞中保持不变。使用外泌体作为载体，LSD1还阻碍了其他癌细胞的T细胞反应，而LSD1缺失挽救了T细胞功能。研究发现，虽然外泌体依赖于供体细胞中LSD1的存在，但它可以调节MFC细胞增殖，其作用取决于外泌体PD-L1介导的体内T细胞免疫。
结论
在GC中，LSD1缺失降低外泌体PD-L1并恢复T细胞反应；这一发现表明了一种新的机制，LSD1可以调节GC中的癌症免疫，为GC的免疫治疗提供了新的靶点。
背景
LSD1在2004年被表征为第一个组蛋白去甲基化酶，它通过RE1沉默转录因子（CoREST）复合物的辅助阻遏物以及雄激素受体特异性地去除组蛋白H3K4的单甲基化和二甲基化，从而导致不同背景下的不同转录调节。由于LSD1参与广泛的生物过程，包括细胞发育、分化、生长、迁移和干性，它在多种癌症中充当癌基因。我们先前的研究证明了在GC中LSD1表达升高并促进了GC的增殖和转移，而用其抑制剂治疗抑制了GC细胞的生长、侵袭和迁移。LSD1还可以通过调节由自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞极化介导的肿瘤微环境来促进肿瘤发展过程。在乳腺癌和黑色素瘤中，抑制LSD1可刺激抗肿瘤免疫并增强程序性细胞死亡1/PD-L1（PD-1/PD-L1）阻滞剂的抗肿瘤功效。然而，LSD1在GC肿瘤免疫微环境中的作用仍不清楚。尽管在约40%的胃食管癌中发生PD-L1上调，并且美国食品和药物管理局（FDA）已批准pembrolizumab和nivolumab用于GC和完全切除的食管或胃食管结合部癌患者，但初步临床数据表明，PD-L1+转移性胃食管癌患者对PD-1/PD-L1抑制剂单药治疗的反应率较低，仅为22%-27%。
在对GC免疫微环境中LSD1功能的探索中，我们通过比较LSD1在免疫缺陷小鼠和正常小鼠中的功能，发现LSD1通过抑制GC中的T细胞活性来维持肿瘤生长。因为LSD1缺失降低了PD-L1的总表达，但保持了其在GC细胞膜上的表达水平。外泌体是由正常细胞和癌细胞分泌的一类直径为30-150nm的小囊泡，由于有报道称外泌体可以携带PD-L1以抑制抗癌免疫，因而引起了我们的注意。在此，我们鉴定PD-L1为GC细胞衍生的外泌体中的一种货物，并且发现在LSD1被消除时GC细胞可以维持细胞膜PD-L1表达并减少外泌体PD-L1的分泌。同时，LSD1缺失可以通过减少外泌体中PD-L1的数量以及抑制PD-L1通过外泌体向其他癌细胞转运来恢复GC微环境中T细胞的杀伤功能，从而抵消其免疫抑制功能。这些结果表明了LSD1抑制GC肿瘤免疫的新机制，并可能为以LSD1作为治疗靶点的GC免疫治疗提供新的策略。
结果
在GC中，LSD1消除通过抑制T细胞反应来抑制肿瘤生长
为了确定LSD1在GC中对肿瘤免疫的调节作用，首先通过TIMER2.0分析LSD1与免疫细胞特征之间的相关性。TIMER2.0是一个提供免疫浸润水平可靠估计的平台。结果显示LSD1与肿瘤浸润性CD8+T细胞呈负相关，主要在GC中（图1a）在不同的免疫细胞中（补充图1a）。使用癌症基因组图谱（TCGA）数据库的进一步分析显示，LSD1的mRNA与GC中的CD8和CD3 mRNA表达呈负相关（图1b和补充图1b）。因此，LSD1被认为通过抑制T细胞反应来维持肿瘤生长。在人GC细胞系BGC-823和MGC-803以及MFC细胞系中建立LSD1 KO细胞系（补充图1c和1d）。然后将MFC和MFC LSD1 KO细胞分别皮下接种到615小鼠和T细胞缺陷型BALB/c裸鼠中。3周后，解剖肿瘤并称重。结果表明，在BALB/c裸鼠中，MFC LSD1 KO组的肿瘤重量和体积与MFC组相当，而在MFC LSD KO组中，615小鼠的肿瘤几乎完全根除（图1c和d），而他们的体重保持一致（补充图1e和1f）。这些结果表明LSD1可能通过抑制T细胞反应来维持肿瘤生长。此外，人GC细胞与抗CD3/CD28微球激活的T细胞共同孵育的结果表明，无论LSD1是否被敲除，BGC-823和MGC-803细胞在体外都能稳定生长（图1e），而当LSD1缺失，这两种癌细胞系可以更容易被活化的T细胞杀死（图1f）。通过分析图1c中615小鼠的剥离肿瘤，LSD1的缺失导致CD8+T细胞浸润增加（图1g），这与图1a的结果一致。总的来说，这些发现表明LSD1是GC中T细胞反应的抑制因子，LSD1缺失可能通过促进体内外T细胞杀伤能力而显著抑制GC细胞的生长。
图1：LSD1 KO可通过促进GC中的T细胞反应来抑制肿瘤生长。（a）利用TIMER2.0分析，GC中LSD1与CD8+T细胞浸润水平之间的关系。（b）利用TCGA数据库中的数据分析（n=407），GC中LSD1与CD8 mRNA之间的关系。（c、d）无论是否敲除LSD1，615小鼠(C)和BALB/c裸鼠(D)的肿瘤图像、肿瘤重量和肿瘤体积曲线(数据以平均值±SD表示，n=6)。（e）存在或不存在LSD1时BGC-823和MGC-803细胞的生长曲线。（f）用抗CD3/CD28激活的T细胞处理，在LSD1存在或不存在的情况下，BGC-823和MGC-803细胞的细胞存活。Scale bar=200 μm. g , 在LSD1存在或不存在的情况下，CD8+T细胞在CD3+浸润性细胞中所占的百分比，这些细胞是从615小鼠肿瘤中分离出来的。
补充图1：LSD1 KO通过调节GC中的T细胞来抑制肿瘤生长。（a）利用TIMER2.0分析，LSD1与GC免疫细胞浸润的相关性。（b）利用TCGA数据库（n=544），分析GC中LSD1与CD3D、CD3G、CD3E的相关性。（c）使用sgRNA敲除或不敲除LSD1的BGC-823和MGC-803细胞中LSD1的表达。（d）使用sgRNA敲除或不敲除LSD1的MFC中LSD1的表达。（e、f）615只小鼠和BALB/c裸鼠在是否存在LSD1时的体重曲线。
在GC标本中，LSD1与CD8呈负相关，与PD-L1呈正相关
肿瘤浸润性CD8+细胞毒性T淋巴细胞被局部分泌的趋化因子募集到肿瘤部位。细胞数量因CD8+T细胞的激活和增殖或耗竭和凋亡而异，这可以由肿瘤微环境中的其他细胞或因子诱导。为了探索LSD1如何影响肿瘤浸润性CD8+T细胞的水平，使用我们内部GC样本构建的组织微阵列（TMA）阻断剂上的IHC分析LSD1、CD8和T细胞吸引趋化因子（CXCL9和CXCL10）的表达。图2a和2b的结果表明LSD1在GC组织中过表达，并且与CD8呈负相关（图2c），而CXCL9和CXCL10在GC组织中几乎不表达（补充图2a）。由于抑制LSD1可刺激抗肿瘤免疫并增强PD-1/PD-L1阻滞剂在乳腺癌和黑色素瘤中的抗肿瘤功效，并且PD-L1是免疫治疗的有效靶点，它可通过结合PD-1抑制T细胞活化，所以我们推测LSD1可能主要通过PD-L1抑制T细胞的活化和增殖而参与GC的发展。为了探索GC中LSD1和T细胞共抑制因子PD-L1之间的相关性，我们收集了36个GC标本并进行了进一步分析。图2d和补充图2b的结果表明，LSD1和PD-L1在癌组织中的表达高于癌旁组织，PD-L1与LSD1呈正相关（图2e）。在TCGA数据库中，胃癌组织中PD-L1表达也与LSD1的mRNA表达呈正相关（图2f）。这些结果初步支持了我们的假设，即LSD1和PD-L1之间可能存在调控关系。
图2：GC标本中LSD1的表达与免疫调节基因呈正相关。（a）经IHC染色的正常胃组织和胃癌组织中LSD1表达的代表性图像。Scale bar = 50 μm.（b）145例胃癌患者在正常组织和肿瘤组织中LSD1的表达分析。（c）145例胃癌患者在肿瘤组织中LSD1与CD8表达的关系。（d）36对GC组织及其相应的邻近癌旁组织中LSD1和PD-L1的表达情况比较。（e）36对GC组织中LSD1与PD-L1的表达关系。（f）TCGA数据库研究GC中LSD1与PD-L1 mRNA的关系。
补充图2：CXCL9、CXCL10和PD-L1在胃癌组织中的表达。（a）CXCL9、CXCL10和CD8在145个GC组织中的表达。（b）LSD1和PD-L1在36对GC组织及其相应的邻近正常组织中的表达。
在GC中，抑制LSD1下调PD-L1
为了进一步探索在GC中LSD1对PD-L1的调节，对一组GC细胞中的总PD-L1和膜PD-L1进行了定量研究。如图3a和b所示，在不同的GC细胞系中，总PD-L1和膜PD-L1的表达明显不均衡。BGC-823细胞系因其PD-L1的相对高表达而被选择用于以下研究，MGC-803细胞系也因其PD-L1的相对低表达而被选择。为了研究LSD1对PD-L1的调节作用，使用LSD1抑制剂GSK2879552（图3c和d，补充图3a）在药理学上消除LSD1或使用sgRNA（图3e和f）在遗传学上消除LSD1。结果表明，当LSD1被消除时，PD-L1在mRNA水平和蛋白质水平的表达上均下调。由于PD-L1是一种跨膜蛋白并在细胞外区域发挥免疫抑制功能，因此我们还评估了当LSD1被消除时GC细胞中膜PD-L1的量。出乎意料的是，膜PD-L1的表达水平没有显著变化（补充图3b和3c），这激起了我们重新定位PD-L1的兴趣。既往研究报道，PD-L1可通过蛋白酶体和溶酶体途径降解，但LSD1抑制剂是否影响PD-L1的降解途径仍有待了解。为了研究这一点，用蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）和溶酶体抑制剂氯喹（CQ）处理GC细胞。补充图3d和3e中的数据揭示LSD1缺失不会减少蛋白酶体或溶酶体对PD-L1的降解。因此，我们的关注从PD-L1的合成和降解途径重新转向了内体转运途径，因为PD-L1能够通过内体的恢复和成熟在细胞质中转运。为探究LSD1在内体转运中的功能，我们检测了恢复内体标记蛋白RAB11和多泡体标记蛋白TSG101的表达。结果显示LSD1缺失可增加RAB11表达（补充图3f），并且PD-L1与RAB11和TSG101在细胞质中共定位（补充图3g和3h）。扫描电镜结果还显示，当LSD1被敲除时，多泡体的数量减少（图3g和h）。同时，当LSD1缺失时，TSG101的表达降低（图3i）。以上结果表明，LSD1缺失可以通过多泡体降低PD-L1总表达，维持膜PD-L1水平以及降低胞外PD-L1的分泌，促进GC细胞中PD-L1再循环到膜上。
图3：抑制LSD1可下调GC中PD-L1基因水平。（a、b）GC细胞系中总PD-L1和细胞膜PD-L1的表达。（c、d）当BGC-823细胞暴露于GSK2879552 5天后，PD-L1的mRNA和蛋白的表达。（e、f）在LSD1存在或不存在的情况下，BGC-823和MGC-803细胞中PD-L1的mRNA和蛋白的表达的影响。（g、h）在存在或不存在LSD1的情况下，BGC-823、MGC-803细胞中多泡小体的形态学和数量的影响。（i）在存在或不存在LSD1的情况下，BGC-823、MGC-803细胞中LSD1和TSG101表达的影响。
补充图3：抑制LSD1并不影响GC细胞中细胞膜PD-L1的表达。（a）当LSD1抑制剂GSK2879552存在或不存在时，PD-L1的表达。（b）在LSD1抑制剂GSK2879552存在或不存在时，BGC-823细胞中PD-L1膜的表达。（c）敲除或不敲除LSD1的BGC-823和MGC-803中细胞膜PD-L1的表达。（d、e）CHX或CQ存在时，敲除或没有敲除LSD1的BGC-823细胞中PD-L1的表达。（f）LSD1存在与否，BGC-823和MGC-803细胞中RAB11的表达。（g）在是否存在LSD1的情况下，MGC-803细胞中PD-L1（红色）、RAB11（绿色）和细胞核（蓝色）的共聚焦图像和定量结果。（h）在是否存在LSD1的MGC-803细胞中PD-L1（绿色）、TSG101（红色）和细胞核（蓝色）的共聚焦图像和定量结果。
在GC中，LSD1缺失下调外泌体PD-L1
先前的研究报道，外泌体PD-L1也可以发挥免疫抑制功能。已知PD-L1是使用外泌体作为载体分泌的，这可能受LSD1的调节。基于这一推论，如前所述通过差速超速离心分离的GC细胞的外泌体进行SEM和NTA。结果表明，GC细胞衍生的外泌体的大小范围为30至200nm（图4a和b）。通过蔗糖梯度离心纯化的外泌体进行的进一步分析表明，外泌体标记CD63、ALG-2相互作用蛋白X（ALIX）和CD9在20%-40%蔗糖部分中传播，并且PD-L1与这些外泌体标记共定位（图4c）。结果表明，PD-L1被GC细胞包装到外泌体中，PD-L1在几种人GC细胞系来源的外泌体中积累（图4d）。为进一步证实外泌体中的PD-L1来自癌细胞而非其他成分，使用外泌体分泌抑制剂GW4869抑制细胞外囊泡的分泌，当BGC-823细胞暴露于GW4869时，当从相同数量的细胞中纯化外泌体时，外泌体分泌明显减少，细胞数量（补充图4a）和膜PD-L1（补充图4b）以及总PD-L1（补充图4c）显著积累。额外的数据表明，当LSD1在BGC-823和MGC-803细胞中被遗传上（图4e）和药理学上（图4f）敲除时，外泌体PD-L1减少，表明LSD1在正向调节外泌体PD-L1积累中的潜在作用。此外，使用基于磁珠的方法，从LSD1缺失的BGC-823和MGC-803细胞中收集的外泌体也比来自野生型细胞收集的外泌体含有更少的PD-L1（图4g和h）。同时，当LSD1缺失时，GC细胞衍生的外泌体的浓度降低（图4i）。因此，LSD1 KO被认为可以维持膜PD-L1并减少外泌体分泌，抑制外泌体分泌有可能挽救这种作用。用GW4869处理BGC-823细胞，并对膜PD-L1进行定量。如前所述，敲除LSD1可以减少总PD-L1的量（图3d和f）但保持膜PD-L1表达（补充图3a和3b）。使用GW4869抑制外泌体分泌可以诱导BGC-823细胞膜PD-L1的积累，GW4869还可以重新诱导LSD1缺失的BGC-823细胞膜PD-L1的积累（图4j）。总之，这些数据表明PD-L1存在于GC细胞衍生的外泌体中，并且LSD1缺失减少了总细胞PD-L1的量，但维持了膜PD-L1表达以及减少外泌体分泌和外泌体PD-L1的积累。
图4：LSD1缺失下调了GC中的外泌体PD-L1。（a）在LSD1存在或不存在LSD1的情况下，从BGC-823细胞中纯化的外泌体(分别为B-EXO和B KO-EXO)的SEM图像。Scale bar = 100 nm.（b）通过NTA分析的BGC-823和LSD1缺失的BGC-823细胞来源的外泌体的大小分布。（c）100000g蔗糖梯度离心后收集的组分分析；BGC-823细胞上清超离心获得的微球。（d）PD-L1在GC细胞来源的外泌体中的表达。（e）PD-L1在BGC-823和MGC-803及其相应的LSD1缺失的细胞来源的外泌体中的表达。（f）GSK2879552和ORY1001处理前后的B-EXO细胞中PD-L1的表达。（g）通过流式细胞术检测，在B-EXO和5μM微球偶联的B KO-EXO中PD-L1的表达。（h）通过流式细胞术检测，在MGC-803细胞（M-EXO细胞）和5μM微球偶联的MGC-803 LSD1 KO细胞（M-KO细胞）PD-L1在外泌体中的表达。（i）B-EXO和B KO-EXO的浓度。（j）用10 μM GW4869处理24h后，BGC-823或BGC-823 LSD1 KO细胞中PD-L1的表达。
补充图4：GW4869下调GC细胞中的外泌体PD-L1。（a）10 μM GW4869处理或不处理，相同数量的细胞中，B-EXO细胞中PD-L1、CD63和ALIX的表达。（b、c）用指定浓度GW4869处理的BGC-823细胞中，细胞膜PD-L1和总PD-L1的表达。
LSD1缺失逆转GC衍生的外泌体PD-L1对T细胞反应的抑制
为确保外泌体PD-L1的功能得以保留，进行了PD-1/PD-L1结合试验，检测外泌体PD-L1与PD-1的结合能力。用PKH26标记的GC细胞的外泌体与包被重组PD-1的孔结合，而当BGC-823细胞中LSD1缺失时，这种结合可以显著消除（图5a）。与此一致，与GC细胞衍生的外泌体一起孵育的T细胞的SEM图像也验证了GC细胞衍生的外泌体可以直接与T细胞结合，而LSD1 KO消除了这种相互作用（图5b）。在肿瘤微环境中，已知癌细胞过度表达PD-L1及其功能，通过与PD-1结合来抑制T细胞受体（TCR）相关途径和免疫功能。为了确定LSD1是否可以通过TCR途径调节外泌体PD-L1介导的免疫抑制作用，用抗CD3/CD28微球激活来自健康人类供体的PBMC，与B-EXO共孵育，建立T细胞刺激模型，测定T细胞的活化和增殖情况。以CD8+T细胞的活化标志物CD69为代表，抗CD3/CD28微球显著增加CD69的表达，而B-EXO处理CD8+T细胞CD69的表达明显下调，而B KO-EXO或用PD-L1抗体阻断外泌体PD-L1的作用或PD-1重组可以挽救CD8+T细胞中CD69的抑制表达（图5c）。同样，在B-EXO存在下，T细胞增殖被抑制，但在LSD1缺失时T细胞增殖能力不下降，表明LSD1 KO去除了GC细胞衍生的外泌体的免疫抑制功能（图5d），这与外泌体中PD-L1的表达水平一致。为了进一步证实外泌体可以调节T细胞对GC细胞的杀伤能力，将活化的PBMC与GC细胞共培养，并用BGC-823细胞来源的外泌体在LSD1存在或不存在的情况下处理。结果表明，外泌体可以减少T细胞杀伤以保持GC细胞存活，而B KO-EXO由于PD-L1的最低表达而对T细胞杀伤没有影响（图5e和f）。同时，T细胞活化过程中分泌的三种主要反应性细胞因子——IL-2（图5g）、IFN-γ（图5h）和TNFα（图5i）的分泌也可被B-EXO抑制，被B KO-EXO拯救。这些发现一致表明，源自GC细胞的外泌体可以直接抑制TCR介导的T细胞活化，这依赖于LSD1调节的外泌体PD-L1。
图5：LSD1缺失逆转了GC来源的外泌体PD-L1的直接T细胞反应抑制。（a）PKH26染色B-EXO和BKO-EXO的代表性共聚焦图像，包被重组PD-1孔。Scale bar = 50 μm（b）T细胞与B-EXO/M-EXO或B KO-EXO/M KO-EXO结合的扫描电镜图像。Scale bar = 1 μm（c）分别用B-EXO或B KO-EXO孵育的CD8+T细胞中CD69的表达。NT表示未使用抗CD3/CD28微球进行处理。（d）与B-EXO或BKO-EXO孵育的抗CD3/CD28刺激的PBMC中的T细胞增殖。（e、f）B-EXO或B KO-EXO与抗CD3/CD28微球激活的PBMC共孵育的BGC-823细胞的细胞存活。左侧为代表性图像，右侧为定量图像。（g-i）在B-EXO或BKO-EXO存在下，ELISA分析抗CD3/CD28刺激的PBMC中IL-2、IFN-γ和TNFα的浓度。
LSD1缺失通过影响靶细胞PD-L1的表达逆转GC细胞衍生的外泌体对T细胞反应的抑制作用
癌细胞衍生的外泌体是肿瘤微环境中细胞间通讯的关键参与者。虽然GC细胞来源的外泌体可以直接抑制TCR介导的T细胞活化，但GC细胞来源的外泌体是否可以将免疫抑制蛋白PD-L1递送至其他细胞，以及LSD1在此过程中的作用仍不清楚。为了探索GC来源的外泌体向其他癌细胞的转运功能，B-EXO和B KO-EXO用荧光PD-L1抗体染色，并与GC细胞系MGC-803一起孵育，结果表明外泌体PD-L1被转运到靶GC细胞（图6a）。正如预期的那样，B-EXO可以诱导靶细胞膜PD-L1的积累，而用B KO-EXO处理的BGC-823细胞没有显著的PD-L1积累（图6b），对总PD-L1也有类似的影响（图6c和d）。因此，当用B-EXO处理时，PD-1与细胞表面的结合显著增加，而PD-1在用B KO-EXO处理的细胞上的结合保持不变（图6e和f以及补充图5a和5b）。因此，当活化的T细胞与B-EXO处理的BGC-823细胞共孵育时，CD3+CD8+T细胞中CD69的表达降低，但在用B KO-EXO处理的细胞组中CD69的表达则没有下降（图6g）。借助T细胞杀伤分析的表型分析也表明，用B-EXO处理的GC细胞有意逃避T细胞杀伤，而B KO-EXO对癌细胞的T细胞杀伤的敏感性没有显著影响（图6h）。这些结果表明，外泌体中的PD-L1可以转运到其他癌细胞中，从而诱导肿瘤细胞从T细胞的免疫逃逸，而LSD1缺失降低了GC细胞来源的外泌体的免疫抑制功能，这提示LSD1是一种潜在的肿瘤免疫治疗免疫抑制因子。
图6：通过影响靶细胞中PD-L1的表达，LSD1的缺失逆转了GC细胞来源的外泌体在T细胞反应中的抑制作用。（a）用20 μg/ml B-EXO或B KO-EXO与MGC-803细胞共孵育24小时的共聚焦图像。外泌体用PKH26染色，然后用膜染色DIO和细胞核染色DAPI染色。有代表性的共聚焦图像显示在左边，定量图像显示在右边。Scale bar = 20 µm （b-d）与B-EXO或B KO-EXO孵育的BGC-823细胞系中PD-L1的膜表达量和总表达量。（e）当用B-EXO或B-KO-EXO孵育细胞时，重组PD-1-Fc与BGC-823细胞-PD-L1结合的共聚焦图像。细胞与抗兔AlexaFluor488染料偶联抗体孵育。Scale bar = 50 μm（f）当细胞与B-EXO或B KO-EXO一起孵育时，PD-1-Fc结合的平均荧光强度（MFI）。（g）当细胞与B-EXO或B KO-EXO一起孵育时，CD8+T细胞中CD69的表达。（h）当与B-EXO或BKO-EXO孵育时，抗CD3/CD28刺激的PBMC中BGC-823细胞的细胞存活。
补充图5：来自含有GC细胞的LSD1的外泌体促进PD-1与受体细胞的结合。（a）当细胞与B-EXO或B KO-EXO孵育时，MGC-803细胞中重组PD-1-Fc与PD-L1结合的共聚焦图像。细胞与抗兔AlexaFluor488染料偶联抗体孵育。（b）当细胞与B-EXO或B KO-EXO孵育时，PD-1-Fc结合的MFI。
在体内，LSD1缺失的GC细胞的外泌体通过减少其PD-L1的表达促进T细胞介导的肿瘤免疫
鉴于GC细胞来源的外泌体在体外抑制了T细胞活化，因此进行了验证性体内实验。与人类GC细胞一致，LSD1抑制剂GSK2879552可以下调MFC细胞中PD-L1的表达（补充图6a），LSD1缺失、LSD1抑制剂GSK2879552和ORY1001均可以降低外泌体PD-L1（补充图6b和6c）。因此，利用携带MFC细胞的615小鼠的建立GC模型，探索GC细胞来源的外泌体是否可以在体内调节肿瘤进展。与最初的发现一致，LSD1 KO显著抑制了615小鼠的肿瘤生长。为了验证LSD1的缺失是否可以通过减少外泌体PD-L1来促进肿瘤免疫反应，将MFC和MFC LSD1 KO细胞（以下分别简称为CON EXO和KO EXO）的外泌体与PD-1或不与PD-1一起孵育以阻断PD-L1，连续21天注射到荷MFC细胞的小鼠的肿瘤中。结果表明注射来自MFC细胞的外泌体的小鼠（MFC+CON EXO组）的肿瘤明显大于未处理的肿瘤（MFC组）。而注射MFC LSD1 KO细胞外泌体（MFC+KO EXO组）的小鼠肿瘤明显小于前两组（图7a-c）。此外，当来自MFC和MFC LSD1的外泌体与PD-1孵育以阻断外泌体PD-L1时（MFC+CON EXO+PD-1组和MFC+KO EXO+PD-1组），肿瘤体积和肿瘤重量在MFC+CON EXO+PD-1组、MFC+KO EXO+PD-1组和MFC+KO EXO组之间没有显著差异（图7a-c）。这些发现使我们假设外泌体处理在一定程度上抑制了肿瘤中的CD8+T细胞浸润。与MFC组相比，MFC+CON EXO组中CD8+T细胞的比例显著增加，而LSD1 KO细胞来源的外泌体促进了CD8+T细胞的比例（图7d）。另一方面，当外泌体PD-L1被PD-1重组体阻断时，MFC+CON EXO+PD-1组中CD8+T细胞的比例高于MFC+CON EXO组（图7d）。同时，MFC+KO EXO和MFC+KO EXO+PD-1组之间CD8+T细胞的比例没有显著差异（图7d）。在这些肿瘤中，对于肿瘤浸润性CD3和CD8表达的分析也获得了一致的结果（图7e和f，补充图6d），细胞因子IL-2和IFN-γ的量亦是如此（图7g和7h）。此外，来自携带MFC LSD1 KO细胞的小鼠血浆中外泌体PD-L1的表达远低于来自携带MFC细胞的小鼠血浆中的表达（图7i），表明LSD1具有通过外泌体PD-L1调节免疫反应的潜力。总的来说，这些结果表明LSD1缺失可以抑制同基因GC模型中MFC细胞的增殖。在体内，外泌体依赖于供体细胞中LSD1的存在，通过外泌体PD-L1介导的T细胞免疫来调节MFC细胞的增殖。
图7：来自LSD1缺失的GC细胞的外泌体通过体内外泌体PD-L1促进T细胞介导的肿瘤免疫。（a-c）在含或不含PD-1重组体情况下，CON EXO或KO EXO处理615小鼠的肿瘤大小、生长曲线、MFC细胞肿瘤重量。（d）CON EXO或KO EXO联合PD-1重组前后，615小鼠MFC细胞CD3+T细胞中CD8+T细胞的比例。（e、f）PD-1重组前后CON EXO和KO EXO对615小鼠MFC细胞CD3、CD8表达的影响。（g、h）不同组615小鼠组织中的IL-2和IFN-γ水平。Scale bar = 600 μm（i）含或不含LSD1的MFC细胞对615小鼠血浆外泌体PD-L1表达的影响。
补充图6：LSD1去除抑制MFC细胞外泌体PD-L1，促进T细胞介导的体内肿瘤免疫。（a）用LSD1抑制剂GSK2879552处理后MFC细胞中PD-L1的表达。（b）PD-L1在CON EXO和KO EXO中的表达。（c）在GSK2879552、ORY1001是否存在时，MFC细胞来源的外泌体中PD-L1的表达。（d）CON EXO或KO EXO及PD-1重组蛋白封闭外泌体组处理的615小鼠MFC细胞的CD3、CD8表达的影响。
讨论
随着癌症检查点靶向治疗的进展，免疫疗法已显示出出色的临床益处。PD-L1是PD-1的功能性配体，被肿瘤利用来减弱抗肿瘤免疫并逃离免疫系统，从而促进肿瘤生长。在之前的研究中，一种LSD1抑制剂可通过PD-L1在黑色素瘤和乳腺癌中促进肿瘤免疫。在这里，基于LSD1在T细胞缺陷小鼠和正常小鼠中的不同功能（图1c），我们假设LSD1可以影响GC中的T细胞浸润，并且发现LSD1缺失的细胞对T细胞杀伤更敏感。数据库和基于临床组织的分析表明，LSD1与GC中PD-L1介导的T细胞浸润相关。深入研究发现，LSD1缺失通过减少PD-L1的分泌来降低PD-L1的表达并维持膜PD-L1的水平，同时伴随GC细胞中多泡体数量的减少以及细胞内膜运输TSG101和RAB11的低表达，这促使我们探索LSD1在外泌体PD-L1中的作用。LSD1调节TSG101和RAB11的作用仍然是一个问题。当然，还有其他可以调节外泌体PD-L1分泌的因素尚未确定，需要进行研究。
LSD1缺失的特征是减少外泌体PD-L1的量，而外泌体PD-L1通过增加靶GC细胞中PD-L1的表达直接抑制T细胞反应。因此，LSD1被证实通过外泌体PD-L1抑制T细胞反应，为LSD1在T细胞免疫中的重要贡献提供了强有力的证据。体内研究还提供了证据表明，LSD1 GC细胞来源的外泌体可以促进肿瘤生长，而LSD1缺失的GC细胞来源的外泌体以依赖于外泌体PD-L1的方式抑制肿瘤生长。尽管如此，由于MFC细胞中LSD1的缺失几乎完全抑制了肿瘤的生长，但没有抑制LSD1缺失的MFC细胞的外泌体，我们认为LSD1在肿瘤免疫中仍然存在其他调节机制（图7）。
总之，我们的研究结果表明，PD-L1被鉴定为GC细胞衍生的外泌体中的一种“货物”，并且当LSD1缺失时，GC细胞可以通过减少外泌体PD-L1的分泌来维持细胞膜PD-L1。同时，LSD1缺失可以通过减少外泌体中PD-L1的数量以及通过抑制PD-L1以外泌体为载体向其他癌细胞转运，抵消其免疫抑制功能，从而恢复GC微环境中T细胞的杀伤功能。这些结果提示LSD1可能抑制GC中肿瘤免疫的新机制，并为以LSD1为靶点的GC免疫治疗提供了新的策略。
结论
综上所述，LSD1缺失通过减少PD-L1在外泌体中的积聚来增强T细胞的活性，从而抑制肿瘤生长，而在GC细胞中，PD-L1膜保持不变。更重要的是，利用外泌体作为载体，LSD1通过外泌体PD-L1阻碍其他癌细胞的T细胞反应，而LSD1缺失则恢复了T细胞的功能。这些发现揭示了LSD1通过胞外PD-L1调节T细胞免疫的新途径，并为以LSD1为靶点的GC免疫治疗提供了新的策略。
专家简介
陈锦霞
余平元
中国科学院大学附属肿瘤医院-温州医科大学联合培养硕士研究生
罗聪
中国科学院大学附属肿瘤医院肝胆胰胃内科医疗组组长
浙江省生物信息学会肿瘤精准医学专委会委员
浙江省免疫学会临床免疫专委会委员
浙江省数理医学学会肿瘤支持治疗专业委员会委员
浙江省转化医学学会干细胞与再生医学分会委员
浙江省毒理学会中毒与救治专委会委员
美国纽约州立大学上州医科大学访问学者
主要从事肿瘤微环境基础及转化性研究，主持浙江省自然科学基金一项，参与多项国家自然科学基金及省课题；作为第一作者及通讯作者发表SCI论文20余篇
苏公网安备32059002004080号
