作者：牛一民 樱井徹郎 孙晖 王喜军
来源：黑龙江中医药大学药学院
砒霜自古为剧毒药，始载于宋《开宝本草》，具有蚀疮、去腐、杀虫、劫痰定喘、劫疟之效。因其毒性难以控制，历代多外用。砒霜的成分主要为三氧化二砷( As2O3) ，为致癌物质，就其毒性而言，有急性毒性和慢性毒性之不同表现。而从砒霜中诞生的亚砷酸注射液，因其对急性早幼粒细胞白血病( APL) 的完全治愈率达80%，成为古老中药在新世纪大放异彩的典范。As2O3对早幼粒白血病基因和维甲酸受体α 基因融合后( Promyelocytic leukemiagene-retinoic acid receptor alpha，PML-RARα) 所产生的致病蛋白的靶向作用和诱导凋亡机制的揭示，向我们展示了如何进一步挖掘中医药宝库的方法和手段。
虽然亚砷酸注射液对治疗APL 有高治愈率和低复发率的优势，且不良反应对大部分患者缓和且可逆，但仍有一定比例的患者出现较为严重的累计多个系统器官不良反应，包括心率失常、急性心功能衰竭、肝功能衰竭、急性肾功能衰竭、全身严重水肿等，甚至导致死亡。本文试图从As2O3在体内的代谢途径和急慢性毒性的发生机制出发，探寻应对亚砷酸注射液不良反应的策略和合适的解决方案。
一、As2O3急性中毒
1．急性砷中毒的症状
急性砷中毒多由短时间误服大量As2O3引起，主要表现为胃肠症状及神经系统症状，入腹后1 ～2h( 快者15 ～ 30min) 即可出现症状，初见咽喉有烧灼感，流涎呕吐，继而出现阵发性或持续性腹痛，泻下粘液血便或米汤样粪便，甚至血水样便，严重者可引起脱水、酸中毒及休克。中枢神经系统症状有头晕，头痛，烦躁不安，惊厥，昏迷，或胸闷气急、腹式呼吸消失等膈神经麻痹症状。死亡原因多是由严重脱水导致的循环衰竭。
2．急性砷中毒的机制
急性砷中毒的细胞分子水平机制罕有人明确提出，但是给予正常细胞高剂量As2O3的实验从本质上重现了急性砷中毒的细胞状态。杨宝峰等在给予H9c2 心肌细胞株2 ～ 10μmol.L-1 As2O3处理后，发现高剂量As2O3引起细胞坏死; 低剂量As2O3使心肌细胞凋亡，AO/EB 染色法观察可见细胞凋亡的特征形态。进一步用Caspase-3 阻断剂Ac-DEVDCHO可以阻断As2O3诱导的凋亡，显示As2O3诱导的H9c2 心肌细胞凋亡与Caspase-3 的激活有关，为进一步研究其凋亡机制奠定基础。邢力举等考察As2O3对正常星形胶质细胞的影响时发现，8μmol.L-1 As2O3可抑制细胞生长，Annexin-v-FITC /PI 双标记法流式细胞仪结果显示了As2O3的促凋亡作用。
砷代谢的氧化甲基化途径相对于凋亡这种有益的正常程序性细胞死亡来说，细胞坏死则是病理状态，两者的区别是坏死的细胞细胞膜破裂，其内容物泄漏，诱导正常组织释放致炎性细胞因子，引起炎症的发生，而凋亡的细胞形成凋亡小体，细胞膜不会破裂，没有内容物的泄出，不会引发炎症。As2O3在高剂量导致细胞坏死可能是急性砷中毒的细胞水平机制。但是否As2O3在不同剂量下的促凋亡和致坏死作用共享一定的分子途径有待实验的进一步证实。
二、As2O3慢性中毒
1． 慢性砷中毒的症状
长期饮用高砷水源或燃烧高砷煤是目前导致慢性砷中毒的主要原因。慢性砷中毒主要表现为食欲减退、疲乏无力、反应迟钝、发落视朦、头晕烦躁、四肢麻木、腿痛跛行; 皮肤接触者可发生皮炎，出现各种皮疹，色素沉着，表皮角化等。流行病学调查显示慢性砷中毒易导致皮肤癌和内脏肿瘤高发。
2． As2O3的代谢途径研究
人们一直认为无机砷的甲基化是解毒过程，因为甲基胂酸MMAV 和二甲基次胂酸DMAV 是无机砷人体内甲基化的主要代谢产物并通过尿液排出体外，其急性毒性比无机砷小。但之后的研究发现氧化甲基化途径的中间代谢产物MMAIII 显示比无机三价砷iAsIII更强的细胞毒性; 同时对慢性砷中毒的研究发现，当将二甲基次胂酸DMAV 添加到食物或饮水中能导致大鼠膀胱癌。故从无机砷到甲基胂是否与慢性砷中毒及其致癌性有某种关联，引发了人们对砷体内代谢途径研究的极大的兴趣。
( 1) 氧化甲基化途径。氧化甲基化途径是将无机三价砷离子iAsIII 最终转化成二甲基次胂酸DMAV，排出体外 。这条途径的特点是只有三价砷才可以被生物甲基化，故五价砷须被砷酸还原酶( Arsenate reductase，E． C． 1． 20． 4． 1) 还原才能参加此途径。S-腺苷甲硫氨酸( S-adenosylmethionine，SAM) 作为甲基供体，由亚砷酸甲基转移酶( Arsenite methyltransferase，E．C． 2． 1． 1． 137，即Cyt19 ) 将iAsIII 转化为甲基胂MMAV 或将甲基亚胂MMAIII 转化为二甲基胂DMAV，其特点是转移甲基的同时将砷由三价氧化到五价。
生物甲基化途径的要求是只有AsⅢ 能被甲基化，故甲基胂MMAV 不能被直接转化为二甲基化物，须先还原为甲基亚胂MMAⅢ 后再添加甲基，此步需要甲基胂还原酶( Methylarsonate reductase，E．C． 1． 20． 4． 2) 的参与，它被鉴定为一种谷胱甘肽的S转移酶( Glutathione-S-transferase omega，GSTO)。但GSTO 敲除小鼠仍能将甲基胂还原为甲基亚胂，说明有替代途径，人们已证实嘌呤核苷磷酸化酶( Purine nucleoside phosphorylase，E． C． 2． 4． 2． 1) 和二氢硫辛酸途径也能将AsV 还原为AsⅢ
( 2) 还原甲基化途径。近来，Hayakawa 等提出另一条砷的代谢途径( 见图2) ，AsⅢ 先与谷胱甘肽( GSH) 结合成复合物，再进行甲基化。此过程因为有GSH 的结合，不必将AsⅢ氧化为AsV，故相对于上条途径称作还原甲基化途径，所用与上条途径中相同的亚砷酸甲基转移酶( Arsenite methyltransferase) 。当GSH 浓度下降时，甲基亚胂酸二谷胱甘肽复合物( MAⅢDG) 和二甲基次亚胂酸谷胱甘肽复合物( DMAⅢ G) 中的GSH 水解，分别形成三价甲基化物，然后被H2O2氧化成甲基胂酸MMAV 和二甲基胂酸DMAV。该砷-谷胱甘肽复合体由肝脏形成后入血运往肾脏，加甲基后该复合物更稳定。
3． 慢性砷中毒的机制
人们对慢性砷中毒的机制研究多集中于As2O3的致癌性是通过何种方式产生，近年来多种致癌机制被提出，包括氧化应激、基因毒性、DNA 修复抑制、DNA 甲基化的改变、影响信号传导、细胞周期调控等。但到目前为止，慢性砷中毒致癌机制尚未明晰，各种理论的提出都尚属假说阶段。其原因可能首先三氧化二砷不是定点突变的致癌物，其作用累计多个系统器官; 其次，砷代谢及毒性作用的种属差异很大，未能在动物上复制出合适的致癌模型。
( 1) 氧化应激。
氧化应激被认为是砷致癌性的一个重要反应机制，已被多种体内外实验证实。如用电子顺磁共振谱检测到低剂量的As2O3可快速增加血管内皮细胞耗氧量并加快形成超氧化物，高香草酸氧化反应可以检测到细胞间H2O2积累增加。用共聚焦扫描显微镜借助荧光探针可以检测到经As2O3处理后细胞内氧自由基水平增加了3 倍，但同时给予氧自由基淬灭剂DMSO 处理后，发现使荧光降至对照组水平。通常认为As2O3毒性是因其能与有生物活性的巯基如谷胱甘肽( GSH) 、硫氧还原蛋白、半胱氨酸等高度亲和，抑制含半胱氨酸残基的多种酶的活性，如丙酮酸脱氢酶、酪氨酸磷酸酶等，使细胞内重要的氧化还原系统不能发挥清除自由基作用，导致细胞内活性氧( Reactive oxygen species，ROS) 水平的升高。这也是皮肤对As2O3很敏感的原因，因为皮肤中有富含巯基的分子如角蛋白，易导致As2O3的蓄积。氧化应激过程中产生的ROS 和RNS，不仅引起细胞功能紊乱，而且易扩散进入细胞核，直接攻击DNA、RNA，或是直接参与胞内及核内的信号传导通路，引起DNA 突变并致细胞癌变。8－羟基脱氧鸟苷( 8－OH-dGuo) 苷是氧化DNA 损伤的生物标记物，在连续14d 给予大鼠口服As2O310 mg.kg-1后，用液相色谱-同位素稀释质谱法检测其尿液中的8－OH-dGuo 含量显著增高，说明发生了氧化DNA损伤。
无机砷甲基化一直被认为是无机砷在人类和多数哺乳动物体内发生生物转化和解毒的主要途径。但是从1989 年Cullen 等报道无机砷代谢的中间产物MMAⅢ对真菌和细菌的毒性远强于无机砷以来，有关MMAⅢ 的毒性研究备受重视，成为砷中毒机制研究的新热点之一。最近的多项研究发现，MMAⅢ等具有比无机砷更强的细胞毒性和遗传毒性，无机砷在大多数哺乳动物和人类体内的代谢和生物转化过程中不再是传统意义上的解毒过程，而很可能是砷中毒发病机制的重要因素之一。目前体外实验中有两种细胞株可以甲基化砷，即大鼠TRL1215 细胞和人UROTSA/F35 细胞，当后者暴露于三价离子砷iAsⅢ18w 后，会呈现高度的氧化DNA损害和癌症表型。而不能甲基化砷的人RPWE-1 和UROTSA 细胞株并不呈现氧化DNA 损害，但仍可在比甲基胂更高浓度的iAsⅢ 作用下出现癌症表型。这个实验说明甲基胂的形成对氧自由基造成DNA损害比无机三价砷有更强烈的作用。此外，关于As2O3的致癌机制研究，有的保持相对独立，有的则直接建立在氧化应激是其上游机制的基础上。但究竟氧化应激是慢性砷中毒所引发的一种现象，还是一种致癌机制有待进一步深入研究。
( 2) DNA 损伤。
除了上述由As2O3致间接所致的氧化DNA 损伤，研究表明当无机砷处理后的仓鼠胚胎细胞、人淋巴细胞和成纤维细胞中都能观察到染色体畸变、DNA-蛋白质交联和姐妹染色单体互换。亚砷酸盐还可通过抑制DNA 连接酶阻碍DNA 的修复，而造成DNA 损伤。改变DNA 甲基化也是慢性砷中毒致癌的机制之一。研究表明，人肺细胞在暴露于As2O3几周后会观察到DNA 中CpG 位点的高甲基化和低甲基化。大鼠肝细胞TRL 1215 经As2O3作用后DNA 普遍低甲基化，具有剂量和时间依赖性。低甲基化易致基因表达异常，由此导致细胞的恶性转化。而给予As2O3急性中毒剂量或未达到转化剂量时，则不会发生低甲基化。这表明砷可以通过高甲基化或低甲基化DNA 来影响基因调控。
( 3) 信号传导通路。
人们已较为透彻地研究了As2O3在治疗APL时诱导细胞凋亡引发Caspase 联级反应的细胞信号传导机制。而慢性砷中毒中As2O3还可以通过影响多种与肿瘤相关联的细胞信号传导通路，涉及AP-1、NFκB、IκB、p53、p21ras 和S-亚硝基硫醇等来影响基因表达系统，其中ROS 和RNS 可起到第二信使的作用。据报道，PKC 家族中3 种同工酶PKCα、PKCε 和PKCδ 能调节As2O3在表皮细胞的信号传导，激活活化蛋白AP-1，亚砷酸盐还可同时诱导c-jun 末端激酶( JNKs) 的激活，AP-1 是由c-fos 和c-jun 基因表达产物结合成的异二聚体蛋白，在多种基因表达的调节中起重要作用。亚砷酸盐可以抑制NFκB 信号传导通路，IκB-α 的丝氨酸残基发生磷酸化修饰后被蛋白酶降解，IκB-α 的去除使NFκB 亚基恢复向核内迁移，进入核内后与DNA 结合，参与核内多种转录调节。这些细胞内信号传导可能涉及As2O3的慢性致癌机制。
三、亚砷酸注射液的不良反应
1． 亚砷酸注射液不良反应的表现
据报道亚砷酸注射液引发的不良反应主要为恶心呕吐、食欲减退、嗜睡、皮疹、面部浮肿、鼻腔出血、腹胀、四肢骨骼疼痛等，但程度均较轻，一般无需停药，给予适当的支持治疗和护理后症状缓解。但Westervelt 等在对10 例APL 患者进行亚砷酸注射液治疗时，第一轮治疗中就出现3 例患者突然死亡。
使用亚砷酸注射液最严重的不良反应，刘霁辉认为是白细胞过多症和骨髓抑制。因白细胞过多可引起弥漫性血管内凝血( DIC) 或加重DIC，纤溶亢进，深部静脉血栓形成，脑血管栓塞引起脑出血，肺血管栓塞导致呼吸窘迫综合征，浸润症状加重，出现视力下降，骨关节疼痛及尿酸肾病等。骨髓抑制的患者则表现为血红蛋白下降和白细胞减少。而甘戈等通过检索1994 ～ 2007 年《中国期刊全文数据库》，对收集到的27 例As2O3严重不良反应( Adverse drug reaction，ADR) 的文献报道进行统计分析。As2O3所致严重不良反应累计多个系统器官，其中分别导致心、肝、肾功能衰竭的例数分别为13 例、6 例、3 例，占23． 2%、10． 71%、5． 38%，全身严重水肿5 例，导致死亡9 例。严重不良反应多发生在用药2 周内。当先停用As2O3，再给予积极的对症支持治疗，包括营养心肌，治疗心律失常，保护肝肾功能，消除水肿等，最终严重ADR 治愈率为56%，死亡率达33%。死亡原因分别为: 急性心功能衰竭( 4 例) ，急性肝功能衰竭( 4 例) ，急性肾功能衰竭( 1 例)。杨琪玫等统计了146 例砷剂治疗中出现的33 例心脏症状，包括心悸，胸闷，心电图变化( 窦性心动过速，S-T 段下移，T 波倒置或低平，PR 间期延长，Q-T 间期延长，室性早搏，尖端扭转型室速，Ⅰ度、Ⅱ度房室传导阻滞或完全性房室传导阻滞) ，多为可逆性，可能与白细胞显著增高有关。患者在亚砷酸的治疗中的不良反应程度，很可能决定于个体对iAsⅢ的解毒与排泄能力，敏感性和耐受性的差异。
2． 亚砷酸注射液不良反应的机制假设
亚砷酸不良反应中，食欲减退、疲乏无力、恶心呕吐、四肢骨骼疼痛、皮疹的症状与慢性砷中毒的某些表现类似，故推测可由As2O3在体内的甲基化代谢和氧化应激等一系列慢性砷中毒的机制来解释。但严重不良反应导致死亡的机制及所表现出的个体化差异的原因则并不是很容易给出假设。从氧化应激的角度去考虑，如果患者体内的某些器官已处在病理状态或还未表现出疾病症状时，其相应的组织和细胞中ROS 水平较高，此时用亚砷酸注射液治疗APL，则必然导致这些“敏感”细胞的坏死或诱导凋亡，从这种假说出发对其不良反应只有对症治疗别无他法。陈竺等的最新研究表明，As2O3直接与癌蛋白PML 端的“锌指”结构中的半胱氨酸结合，诱导蛋白质发生构象变化和多聚化，继而发生SUMO化修饰而被蛋白酶体降解。如果As2O3可与癌蛋白PML 端直接结合，那么在影响其他正常细胞时是否有与某种特定蛋白结合所导致的坏死和凋亡，即ROS 仅是现象，所引发的信号传导通路的改变另有蛋白的作用; 若此假设成立，是否能存在能拮抗这种特定结合的药物却又不阻滞与癌蛋白PML 端的结合，以期达到降低亚砷酸注射液不良反应的效果，有待进一步的研究和发现。
综上所述，亚砷酸不良反应及其临床表现出的食欲减退、疲乏无力、恶心呕吐、四肢骨骼疼痛、皮疹等症状与慢性砷中毒类似，但其机制尚不十分明确，目前对As2O3代谢途径的阐述以及慢性毒性机制中氧化应激、DNA 修复抑制、DNA 甲基化的改变、影响信号传导及细胞周期调控等研究，仍不足以为亚砷酸不良反应的机制提供确切的答案。亚砷酸的治疗作用和其不良反应之间的关联性有待深入研究，以为寻找减毒增效或减毒不减效的联合用药提供充分的科学依据。
责任编辑：Dr.q
来源：doi: 10.3969 /j. issn.1674 － 3849. 2011. 02.029
苏公网安备32059002004080号
