免疫检查点抑制剂治疗在肿瘤治疗方面取得了突破性的成果，然而在治疗肝癌的随机临床试验中没有明显的改善作用，可能原因是存在原发性或获得性耐药，因此，目前迫切需要探索PD-1单抗的耐药机制、确定联合治疗策略，以提高肝癌治疗疗效。
近日，Journal of Hepatology杂志发表了由复旦大学中山医院樊嘉院士团队攻克的肝癌相关PD-1单抗最新耐药机制。
研究背景
肝细胞癌（HCC）在全球范围内是最常见的肿瘤之一，有相当一部分患者在被诊断为肝癌时处于晚期，因此不能接受根治性手术。近年来，免疫检查点抑制剂（ICB）治疗，尤其是PD-1/PD-L1抗体在肿瘤治疗方面取得了突破性的成果。然而，抗PD-1治疗的随机临床试验（KEYNOTE-240，CheckMate-459）在治疗肝癌患者方面没有显示出统计学意义的改善，可能是由于存在PD-1单抗原发性或获得性耐药，因此，目前迫切地需要探索ICB治疗的耐药机制、确定联合治疗策略，以提高其对肝癌的疗效。
肝脏中有大量巨噬细胞，包括驻留（Kupffer细胞）和募集来的巨噬细胞，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）在介导肿瘤进展、免疫逃逸和转移、ICB耐药中发挥重要作用，逆转M2表型、阻断TAM的招募和消除TAM的浸润有望成为改善ICB的有效策略肝癌的治疗效果。锌指蛋白64（ZFP64）基因位于20q13.2，据报道，该基因扩增与转移发生、生存率降低有关。
研究方法
本研究进行了二代测序（NGS）、多重免疫荧光、免疫组化，研究中构建原位肝癌异种移植瘤模型来鉴定PD-1耐药相关关键基因。研究者应用转基因小鼠自发肿瘤模型、体外共培养系统、流式细胞术、多重免疫荧光等方法检测锌指蛋白64 (ZFP64)在肿瘤进展和免疫逃逸中的作用，利用RNA-seq, ChIP-seq和质谱分析来研究ZFP64介导耐药的机制。
研究结果
ZFP64与PD-1耐药、肝癌患者不良预后密切相关
研究者对接受抗PD-1治疗的HCC患者的活检标本进行了NGS分析，通过MRI每两个月一次监测治疗效果，根据iRECIST评价治疗效果。研究共招募41例患者，客观缓解率和疾病控制率分别为17.1%和61.0%。10例PD、7例PR的组织样本用于测序，确定了2090个DEG（PD vs. PR，图1C，左）。随后，对发现队列和TCGA的DEG进行了交叉队列（T与N，图1C，右），发现39个上调基因、3个下调基因（图1D-E）。
图1. ZFP64与PD-1单抗耐药和不良预后密切相关
ZFP64是上调基因之一，在发现队列中，与SD或PR样本相比，PD样本中ZFP64表达增加，而PD样本中CD45阳性免疫细胞减少。在原位异种移植瘤模型中，ZFP64过表达组（Hepa1-6-ZFP64）肿瘤负荷大于空载组（Hepa1-6 -EV）。抗PD-1治疗后，Hepa1-6-EV组的肿瘤负担显著降低，而在Hepa1-6-ZFP64组中未观察到统计学差异，抗IgG治疗后两组无明显差异。
在TCGA队列中，肝癌中ZFP64的表达显著升高，预后分析显示ZFP64升高与TCGA和TMA2队列中HCC患者出现恶性表型和不良预后，多因素分析结果提示ZFP64是术后OS和DFS的独立预测因子。
ZFP64促进HCC进展并诱导抑制性肿瘤免疫微环境（抑制性TIME）
随后，研究者探讨ZFP64在肝癌中的作用，建立ZFP64敲除（sgZFP64）MHCC97H和ZFP64过表达的PLC/PRF/5和HepG2细胞系，发现ZFP64高表达细胞的增殖、迁移和侵袭能力与ZFP64low细胞相比更强。通过将细胞皮下注射在异种移植肿瘤模型中，发现ZFP64high组与ZFP64low组相比，肿瘤重量更大、凋亡细胞更少。然后，应用HBV转基因自发肿瘤模型小鼠（Tg[Alb1HBV]44Bri/J）过表达ZFP64，15个月后收集肝脏和肺组织，发现ZFP64高表达组肝硬化发病率增加，肿瘤形成和肺转移增多、肿瘤体积更大、肿瘤病变更多、凋亡细胞更少。
通过质谱CyTOF和t-SNE分析，将细胞分为11个亚群，发现ZFP64过度表达组巨噬细胞显著增加，而CD8+和CD4+T细胞显著降低。进一步分析表明，增加的巨噬细胞主要表现为M2表型，多重免疫荧光证实了CyTOF的结果。
肝癌ZFP64 促进巨噬细胞募集以及M2极化
研究者用佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-醋酸盐（PMA）处理THP1细胞将其分化成巨噬细胞，与ZFP64high肝癌细胞共培养后，巨噬细胞表达高水平的CD163和CD206膜蛋白，显示CD206、ARG-1、IL-10和TGF-β mRNA的上调，以及产生更多的IL-10和TGF-β1。通过趋化迁移分析，发现ZFP64高HCC细胞促进了细胞的趋化性募集巨噬细胞。此外，与ZFP64high HCC共培养的巨噬细胞和与ZFP64low肝癌细胞共培养的巨噬细胞相比，ZFP64高HCC细胞可更强烈地抑制T细胞增殖和活化。总之，这些结果表明ZFP64过表达的HCC细胞促进巨噬细胞募集和M2样极化。
ZFP64通过转录因子促进巨噬细胞极化和募集CSF1激活
为了确定ZFP64调控的靶点，研究者对PLC/PRF/5细胞进行RNA-seq和ChIP-seq分析，得出了一段20核苷酸序列基序与ZFP64占有率密切相关。接下来，使用BETA软件整合RNA-seq和ChIP-seq数据，发现ZFP64可同时作为转录激活物和转录抑制物。
随后，研究者将RNA-seq和ChIP-seq数据进行交叉，获得85个基因。通过进行KEGG分析，发现ZFP64升高与RAS/MAPK、PI3K/AKT和TGF-β途径有关，并通过免疫印迹法证实ZFP64升高使p-AKT和p-ERK1/2水平升高。GO分析显示增强的ZFP64与单核细胞/巨噬细胞活化和迁移有关。相关性分析表明，在TCGA队列中ZFP64与大多数基因相关，包括CSF1。通过使用102细胞因子阵列试剂盒，发现PLC/PRF/5-ZFP64细胞比CSF1PLC/PRF/5-EV细胞上清液中CSF1更高，因此推断CSF1可能是其中之一关键转录靶点。
ZFP64经过磷酸化修饰，其中Ser226（S266）报告次数最多。研究者制备了一种抗体，能够特异性识别磷酸化蛋白质ZFP64S226（KHLRIHpSDERPFK）， 发现ZFP64S226A主要存在于细胞质中。通过检测细胞质和核提取物中ZFP64的水平，研究者进一步确认S226A突变与ZFP64核易位减少有关。
Gö6976通过靶向PkCα/ZFP64/CSF1轴改善TIME、提高PD-1单抗疗效
PKCα抑制剂Gö6976可呈剂量和时间依赖性地抑制PKCα/ZFP64/CSF1，并降低膜定位PKCα和核定位ZFP64（图2A-C）。在患者来源的异种移植（PDX）和原位异种移植肿瘤模型中，研究者发现Gö6976治疗组的肿瘤重量显著低于载体组（图2D，F）。与载体组相比，Gö6976治疗组的p-PKCα、p-ZFP64、CSF1降低，核定位ZFP64水平降低，F4/80+和CD206+细胞减少，CD4+、CD8+和凋亡细胞增加（图2E，G-H）。然而，腹腔注射重组小鼠CSF1可逆转Gö6976诱导的肿瘤抑制和免疫改善。
随后，研究者推测阻断PKCα/ZFP64/CSF1轴可能会提高抗PD-1的疗效。为了验证这一点，研究者引入了Gö6976和另一种抑制剂BLZ945（靶向CSF1R）来阻断PKCα/ZFP64/CSF1轴。发现在HEPA1-6-EV组中，Gö6976、BLZ945、抗PD-1、Gö6976或BLZ945联合抗PD-1抑制肿瘤生长；而在Hepa1-6-ZFP64组中，抗PD-1不能抑制肿瘤生长，Gö6976或BLZ945部分抑制肿瘤生长，Gö6976或BLZ945与抗PD-1联合显著抑制肿瘤生长。因此，研究者发现联合治疗改善了肿瘤免疫微环境，CD4+、CD8+细胞增加，F4/80+和CD206+细胞减少，尤其是在ZFP64过表达组。研究中没有观察到这些小鼠体重的变化或明显的副作用。
图2. Gö6976通过靶向PkCα/ZFP64/CSF1轴改善肿瘤免疫微环境、提高PD-1单抗疗效
讨论
尽管抗PD-1疗法在多发性实体瘤中得到了成功应用，但仅使一小部分肝癌患者受益。在这项研究中，研究者证明ZFP64升高与抗PD-1耐受性和HCC患者的不良预后密切相关。具体而言，研究者发现了PKCα在S226磷酸化ZFP64并促进其核易位，从而转录激活CSF1。这一过程进一步诱导巨噬细胞的募集和M2样极化，诱导免疫逃逸和抗PD-1耐受，临床上PKCα/ZFP64/CSF1轴经常表现出抗PD-1的耐药性。
多项研究表明ZFP64可能加速肿瘤进展，但确切机制尚不清楚。研究者证实ZFP64促进了肿瘤的进展，结果提示肝癌患者预后不良。值得注意的是，研究者首次证明高ZFP64水平诱导肿瘤免疫微环境。CSF1是一种中枢细胞因子，调节单核细胞/巨噬细胞的分化、存活和增殖，促进其募集和分化。研究者证实ZFP64通过直接结合其启动子区域转录调控CSF1表达，然后分泌CSF1强烈诱导招募的巨噬细胞M2极化，从而诱导抑制时间并促进肿瘤进展。M2巨噬细胞在免疫逃逸和ICB治疗抵抗中起关键作用。最近的一项研究表明，M2浸润程度高的患者往往对抗PD-1治疗产生耐药性。此外，CSF1还通过肿瘤细胞表达的受体CSF1R激活多种信号，从而促进肿瘤进展。综上所述，研究者证明ZFP64/CSF1轴是HCC肿瘤进展和抗PD-1耐药性的强大驱动因素。
在这里，研究发现PKCα，一种重要的蛋白激酶，直接与ZFP64在S226处磷酸化，并促进其核易位和细胞凋亡靶基因的转录激活。临床上，高水平的p-PKCα，p-ZFP64，CSF1的发生频繁且伴随而来，且过度激活PKCα/ZFP64/CSF1轴通常诱导肿瘤免疫微环境。研究还发现尽管由于样本量的原因在大多数情况下未表现出统计学差异，但PKCα/ZFP64/CSF1轴与抗PD-1疗效呈正相关。研究进一步介绍了PKCα的经典抑制剂Gö6976，先前研究表明该抑制剂可延缓数种肿瘤进展。肿瘤植入两天后进行Gö6976治疗可预防92%的肿瘤形成，而植入后七周的治疗导致完全的已确定肿瘤的消退。本研究发现Gö6976可抑制肿瘤生长HCC中PKCα/ZFP64/CSF1轴的进展、改变肿瘤免疫微环境。重要的是，本研究提供了大量证据证明Gö6976联合抗PD-1治疗能协同提高荷瘤小鼠的存活率，尤其是ZFP64过度表达的HCC实验对象中。
总之，本研究证实PKCα/ZFP64/CSF1轴通过促进招募的巨噬细胞向M2样极化从而有利于抑制肿瘤免疫微环境，而经典PKCα抑制剂Gö6976重塑肿瘤微环境并逆转抗PD-1耐药性。综上，本研究为抗PD-1的联合治疗提供了一个有潜力的治疗方案。
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