10年前，我们开启了细胞核内miRNA的研究；5年前，我们发表了第一项核内miRNA研究成果，发现并定义了一类在细胞核内具有激活功能的RNA——NamiRNA (Nuclear activating miRNA)，提出了NamiRNA-增强子-基因激活的新理论；5年后的今天，我们发表了NamiRNA第二项重要研究成果，揭示了肿瘤中抑癌基因沉默的新机制，为唤醒沉默的抑癌基因提供了全新的思路。
抑癌基因失活是细胞癌变过程中常发生的事件。DNA甲基化可调控基因的活性，启动子区域的高甲基化通常会抑制基因表达，这可以解释细胞癌变过程中部分抑癌基因的失活。然而，大量的抑癌基因启动子区域并没有出现所预想的高甲基化，这些抑癌基因在肿瘤中的低表达就成了肿瘤领域的未解之谜，如何唤醒沉睡的抑癌基因更成了肿瘤研究领域可望而不可及的梦想。
癌基因和抑癌基因是我们生物医学领域耳熟能详的名词，癌基因的高表达或获得性突变以及抑癌基因的低表达或缺失性突变被认为是肿瘤发生的最重要的原因(1,2)。抑癌基因一个显著的特征是在肿瘤中低表达。我们不禁要问两个重要的问题：1）抑癌基因为什么会在肿瘤中的低表达？2）如何激活抑癌基因用于肿瘤的治疗？
关于抑癌基因为何在肿瘤中低表达，这涉及肿瘤表观遗传学领域早期的著名争论——肿瘤到底是与低甲基化还是高甲基化有关，这一争论时间跨度长达15年。这就不得不提到肿瘤甲基化领域的“三驾马车”，他们共同推进了肿瘤DNA甲基化领域的研究。第一位就是我在美国博士后期间的老板、约翰·霍普金斯大学Andrew Feinberg教授，他于1983年在Nature 杂志发文揭示了全基因组水平的低甲基化是肿瘤的重要特征，他是将DNA甲基化与肿瘤联系起来的第一人。但有意思的是，他在这篇文章中说不清肿瘤的低甲基化是如何导致肿瘤的。两年后的1985年，约翰·霍普金斯大学另一位著名的教授Stephen Baylin发现抑癌基因的启动子区域存在高甲基化，进而阐明启动子区域高甲基化导致抑癌基因的低表达是肿瘤发生的重要原因。这就形成了一个悖论，肿瘤的发生到底是因为DNA低甲基化还是高甲基化，一时间DNA高甲基化占据上风，因为启动子区域的高甲基化导致抑癌基因的下调很好的符合了肿瘤发生的“二次打击”学说。对这件事起到推波助澜作用的还有另一位肿瘤DNA甲基化领域的著名教授Peter Jones，他于1977年发现核酸类似物5-azacytidine (5-AzaC)可以显著上调基因的表达，最后发现5-aza-C主要与DNA去甲基化有关，大约在1990年前后基本上奠定了抑癌基因的高甲基化与肿瘤发生的稳定关系，这逐渐形成了肿瘤领域的共识，推动了DNA去甲基化药物用于肿瘤治疗。
尽管DNA高甲基化导致抑癌基因的下调已成为肿瘤领域的共识，但并非无懈可击：1）抑癌基因有接近1000多个，但通过DNA甲基化下调的抑癌基因并没有想象的那么多，那么大部分抑癌基因是怎样下调的呢？启动子甲基化解释所有抑癌基因的下调显然力不从心。2）5-AzaC 是一个广谱的DNA甲基化抑制剂，对抑癌基因的激活没有选择性，其肿瘤治疗效果有限，如何激活抑癌基因就成了肿瘤领域的一个“烫手山芋”，人人想吃，但无从下口。这就催生了一个重要的问题：启动子甲基化导致抑癌基因下调是普遍规律吗？是否还有其他机制？是否能够基于这种机制，特异性地激活被抑制的抑癌基因，为肿瘤治疗带来新的曙光？
复旦大学于文强课题组自2009年起致力于核内miRNA激活研究，提出NamiRNA (Nuclear activating miRNA)通过增强子激活基因表达的全新理论。近日，复旦大学于文强课题组联合北京中科院生态中心汪海林课题组以及复旦大学附属肿瘤医院李大强课题组，揭示了NamiRNA-增强子介导的抑癌基因的失活机制，并发现可通过NamiRNA-增强子网络可重新激活抑癌基因，提示NamiRNA-增强子可作为癌症治疗的全新靶点。相关研究于2021年7月30日在线发表在Nucleic Acid Research杂志（下文简称NAR）杂志（图1）。
图1. 相关工作发表在2021年7月30日的NAR
启动子高甲基化失活抑癌基因？Not the Whole Picture!
DNA甲基化能改变染色质结构和DNA构象与稳定性，启动子的DNA甲基化可以导致转录沉默，进而引起基因的低表达或者失活(3)，如常见的抑癌基因VHL（Von Hippel Lindau肿瘤抑制因子），p16INK4a（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A[CDKN2A]），BRCA1（乳腺癌易感性基因1）和hMLH1（人类错配修复基因）等在肿瘤中低表达是由于启动子区域高甲基化(4,5)。然而，对于TSGene数据库公布的983个肿瘤中低表达的抑癌基因(6,7)，抑癌基因低表达与启动子高甲基化关联的报道并不多。那么，其中有多少个基因的低表达是抑癌基因启动子甲基化引起的？抑癌基因在肿瘤中表达下调是否还有其他因素？本次研究通过系统的生信分析发现，乳腺癌中有622个抑癌基因，其中383个抑癌基因低表达。出乎意料的是，与正常对照组相比，乳腺癌中约68%低表达的抑癌基因启动子甲基化状态没有发生显著高甲基化（图2）。
图2. 乳腺癌中低表达抑癌基因的启动子甲基化分析。秩和检验分析结果表明，和正常对照相比，乳腺癌中68.2%的低表达抑癌基因启动子没有高甲基化（红色框标注）。
NamiRNA-增强子-基因激活通路: The Neglected but Important Player!
既然在乳腺癌中启动子高甲基化无法解释抑癌基因的低表达现象，那么抑癌基因的表达受到哪些因素调控呢？
鉴于增强子与启动子一样是顺式调控元件，本研究选取这68%没有甲基化差异的抑癌基因，对它们的增强子标记H3K27ac在乳腺癌样本和正常对照中的富集进行了分析，结果显示有相当一部分抑癌基因（45/212）的增强子上H3K27ac在乳腺癌组织中的富集程度要显著低于正常对照组，提示增强子可能与乳腺癌中抑癌基因低表达相关。
miRNA作为一种长度为18~23个核苷酸的非编码小RNA，通常被认为在细胞质中通过结合靶基因的3’-UTR降解mRNA或抑制翻译从而发挥负向调控作用。随着miRNA 研究的不断深入和深度测序技术的发展，越来越多的证据表明，miRNA 不仅可定位于细胞质，而且也存在于其他细胞器中，miRNA的不同细胞定位影响miRNA的功能(8)。
复旦大学于文强课题组专注于细胞核内miRNA研究十余年，在前期工作中对ENCODE数据库中7种不同细胞系1594条miRNA前体进行系统分析，发现300多条miRNA前体在基因组中的位置与增强子高度重叠，这些miRNA包括hsa-miR-24、hsa-miR-3179等；miR-3179被证实能激活邻位基因ABCC6 和 PKD1P1，miR-24-1能激活靶基因FBP1和FANCC的表达(9)。这类miRNA定位于细胞核中并且通过靶向增强子进而激活临近或远端基因，这类细胞核内具有激活功能的miRNA定义为NamiRNA (Nuclear activating RNA)(9,10)。相关研究于2017年发表在RNA Biology，Google Scholar显示该文章至今被引154次。
图3. NamiRNA相关工作的原始文章
在肿瘤中，大量研究已经揭示了miRNA低表达与肿瘤发生发展的关联。miRNA在肿瘤中低表达是肿瘤的另一个重要特征，很多miRNA在正常组织中的表达要高于肿瘤(11)。如let-7家族miRNA可负向调控MYC及RAS家族癌基因的表达从而抑制肿瘤发展，且let-7家族miRNA在多种癌症中低表达并与不良预后相关(12,13)；肝脏细胞中miR-199a和miR-199b表达下调，与肝癌的发生发展有关(14)。另一方面，增强子是一类促进基因转录的DNA顺式调控元件，可近距离或远距离调控基因的表达，在细胞分化、组织发育、个体生长和肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。H3K27ac是激活状态增强子（active enhancer）的标记。增强子相关的染色质修饰异常引起抑癌基因的增强子失活或者癌基因增强子的异常激活都与肿瘤的发生有密切关系(15)。因此，本研究将miRNA和增强子两个重要的调控元件联系起来。
miR-339-增强子-GPER1调控: Too Good to Be True
乳腺癌是全球发病率最高的癌症，也位列我国女性恶性肿瘤发病首位。三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）具有高侵袭性、易转移的特点，目前尚无有效治疗手段，因此寻找新的靶点和有效治疗药物迫在眉睫。
结合NamiRNA-增强子-基因激活通路的研究(9)以及乳腺癌中增强子的异常，我们推测乳腺癌中可能存在大量低表达的NamiRNA，进而通过NamiRNA-增强子通路，丧失了对抑癌基因的激活作用，最终导致了抑癌基因的低表达。
首先我们分析得出乳腺癌中低表达的NamiRNA候选基因，通过mRNA-seq分析（图4）以及绝对定量PCR实验验证，优先筛选出在乳腺癌中低表达的miR-339和靶向激活的抑癌基因GPER1作为研究对象。
图4. mRNA-seq分析在乳腺癌细胞4175中过表达miR-339激活的基因，其中包含GPER1。
有意思的是，GPER1是同一条染色体（Chr7）上距离miR-339最近的抑癌基因，在UCSC Genome Browser里可以查到miR-339就在GPER1上游60kb的位置，并且ENCODE数据也显示miR-339的基因座位置的H3K27ac富集 （图5）。
图5. UCSC上miR-339和GPER1在7号染色体上的位置。UCSC截图显示ENCODE数据中miR-339位置有显著的H3K27ac富集，提示miR-339和增强子位置重叠，其中不同的颜色代表不同的细胞类型。
为了进一步验证，本研究收集了157对不同分子分型的乳腺癌组织（Luminal A，Luminal B，HER2富集型和三阴性乳腺癌）及相应的癌旁对照组织进行了RT-qPCR检测，结果表明与对照组织相比，miR-339和抑癌基因GPER1在Luminal型及三阴性乳腺癌组织中表达下调，而在HER2富集型乳腺癌组织中没有明显差异（图6）。同时，miR-339可作为乳腺癌潜在的分类标记，对于miR-339低表达的乳腺癌患者，通过miR-339再激活GPER1，有可能带来福音。
图6. 不同类型乳腺癌组织中miR-339和GPER1表达情况和相关关系。
那么，miR-339和抑癌基因GPER1对乳腺癌细胞行为学会产生怎样的影响呢？首先，在Luminal乳腺癌细胞系T47D和三阴性乳腺癌细胞系4175中过表达外源性miR-339，结果提示在这两个非HER2富集型乳腺癌细胞中过表达miR-339后抑癌基因GPER1的表达均被激活，并且它们的增殖和克隆形成能力均受到明显抑制，表明过表达miR-339可再激活（reactivate）抑癌基因GPER1，进而抑制乳腺癌细胞生长及增殖；也提示miR-339可以作为三阴性乳腺癌的治疗提供潜在的靶点（图7）。
图7. miR-339过表达可重新激活抑癌基因GPER1并抑制乳腺癌细胞生长和增殖。
此外，机制研究上，本研究通过双荧光素报告基因实验证明了miR-339 locus具有增强子活性；ChIP-seq结果表明过表达miR-339可以提高靶基因增强子活性（图8）；另一方面，利用CRISPR/Cas9敲除技术破坏增强子序列完整性后，miR-339不能再激活GPER1（图9）。增强子就像开关一样，过表达NamiRNA会提高增强子活性，打开促进靶基因表达的开关；反之，NamiRNA低表达就会降低增强子活性，关闭促进靶基因表达的开关。
图8. ChIP高通量测序分析。过表达miR-339可以激活增强子活性，ChIP-seq分析过表达miR-339后，miR-339 DNA locus位置附近H3K27ac富集明显高于对照组。
图9. CRISPR系统破坏增强子完整性后，过表达miR-339不能激活GPER1。
NamiRNA激活沉默的抑癌基因潜力无限：Too Simple but Powerful!
为了探究过表达miR-339再激活GPER1是否可以对乳腺癌细胞发挥抑制作用，我们进行了动物荷瘤实验。结果表明，过表达miR-339可以抑制乳腺癌发展与增殖，提示miR-339是乳腺癌潜在的治疗靶点，可为乳腺癌治疗提供新的线索和思路（图10）。
图10. 动物荷瘤实验。NamiRNA作用不仅有效而且特异性，提示NamiRNA做为小核酸药物的巨大潜力。
NamiRNA不怕做不到，就怕想不到
图11. 在正常和肿瘤细胞中miR-339-增强子介导的抑癌基因GPER1的活性
本研究阐明了抑癌基因在肿瘤中的低表达与增强子及miRNA的异常调控有关。本次工作在分子机制上对miR-339通过增强子靶向激活抑癌基因GPER1进行了较为详细的阐述。此外，乳腺癌中抑癌基因GPER1低表达与miR-339低表达有关，细胞行为学实验及动物实验结果均表明过表达miR-339后可再激活抑癌基因GPER1进而抑制乳腺癌细胞的生长与增殖，提示miR-339可为乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌提供潜在的治疗靶点和策略。
NamiRNA研究开展10年多，由最初的假说到实验验证，实验室的学生走了一波又一波，套用我们实验室学生的话说，在NamiRNA研究的星辰大海中，谁信不重要，自己信最重要。NamiRNA研究已经成为我们实验室重要的研究方向，先后有10余人投入其中，涉及NamiRNA作用机制、重要表观遗传现象的另类解释、疾病治疗新策略、重要传染性疾病新的预防方案等。
我们深知一个全新的研究方向要得到科学共同体的认可需要时间，对科学研究者来说，我们坚信科学真理不是用来膜拜的，而是用来颠覆和超越的，只要方向对了，到达胜利的终点只是时间问题。这世界本没有路，总得有人去披荆斩棘。感谢汪海林老师、李大强老师，相信本身就是一种无穷的力量。昨天我们孤独前行，今天我们结伴而行，明天我们将一起大步前行。
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