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侯健教授：各位同道大家好，我是上海交通大学医学院附属仁济医院的侯健医生。
华氏巨球蛋白血症（WM），是非霍奇金淋巴瘤的一种亚型，以单克隆IgM分泌和骨髓浆样淋巴细胞浸润为主要特征。WM是一种罕见的疾病，发病率为每年每百万人3-4例。相对而言，IgM-MGUS在人群中更为常见，可进展为WM。基因突变是WM的重要致病因素。目前全基因组测序表明，MYD88和CXCR4 WHIM样体细胞突变分别发生在90%以上和30-35%的WM患者中。
许多研究显示WM或其他B淋巴细胞增殖性疾病在WM患者的一级亲属中家族性聚集，包括NHL、MM、CLL、MGUS、ALL、HL，这些发现均揭示了遗传易感基因在WM和其他B淋巴细胞增殖性疾病中的重要作用。目前，基于家族性WM胚系基因的遗传学研究非常有限。
上海交通大学医学院附属仁济医院血液科团队在家族性WM中，筛选并鉴定了一个FHL2新型突变。该突变为家族系病例的筛查提供了新的可能，也为研究B淋巴系统肿瘤的癌变机制提供了新的见解。研究成果于近日发表在《Cancer》杂志。
鉴定家族性WM双胞胎患者中新型FHL2g226a突变
在本研究中，我们对一对同卵双生患者（一位诊断为WM，另一位诊断为IgM-MGUS）及他们三个健康的兄弟姐妹的胚系DNA样本进行了全外显子组测序。初步筛选发现了10个罕见的、外显的非同义单核苷酸变异，同时对应10个基因。利用M-CAP评分对这些突变进行致病性预测，根据数值由高到低，我们优先考虑双胞胎共有的且有害性较高的突变。其中FHL2和ZMAT5是未报道过的新突变。
接下来，我们继续对候选基因变异进行优先级排序，以便筛选出相关度最高的家族性WM的基因突变。首先，对公开发表的基因表达数据集（GSE6691）进行分析，发现了111个基因的表达在WM患者和健康供者之间存在显著差异，将这些差异基因定义为WM细胞特异标志（图1-a）。对这些差异基因和家族性WM候选基因进行PPI网络分析（图1-b），共获得294对蛋白互作关系，其对应的基因包括GSE6691中76个差异基因，以及四个家族性WM候选基因（FHL2、MICALL1、CHST4和DOCK2）。
FHL2与已知的WM疾病驱动分子IL-6和HCK存在互作关系。研究发现，FHL2表达增加可促进髓系祖细胞进入细胞周期，并增加骨髓细胞的凋亡。基于这些研究，FHL2被认为是一个潜在的抑癌基因或癌基因。因此，我们认为FHL2与血液病的发生发展及免疫系统密切相关。结合M-CAP评分、PPI网络分析结果，我们鉴定FHL2是四个候选基因中与家族性WM最相关的靶标。
图1 鉴定与WM相关的候选变异
FHL2g226a突变的特征
Sanger测序证实，仅双胞胎患者存在FHL2g226a突变，而其他健康的家族成员不存在该突变（图2）。 FHL2g226a突变在Twin1（WM）和Twin2（IgM-MGUS）中的VAF值分别为0.3984和0.4872，这证实该突变在双胞胎中均为杂合变异。
图2 FHL2g226a突变的Sanger验证。
突变点位于FHL2基因的3号外显子（图3-a）。FHL2的蛋白质由螺旋状、链状和卷曲螺旋状结构组成。该突变为错义突变，卷曲螺旋状位点上缬氨酸由蛋氨酸取代（图3-b,c）。 FHL2g226a突变的稳定性变化（ΔΔG）为-0.549 Kcal/mol，可能导致蛋白质失稳。
图3 FHL2g226a突变的特征
家族先证中FHL2的表达水平
FHL2g226a是胚系突变，也存在于双胞胎患者的外周血细胞中。我们采用qPCR和WB方法检测了Twin1（先证者）和其他两个健康兄弟PBMCs中FHL2的表达。遗憾的是，我们暂无法获得Twin2患者的外周血样本。结果显示，Twin1的PBMCs中FHL2 mRNA和蛋白的表达均显著低于健康兄弟（图4-a，b）。这表明FHL2的功能因突变而受到损害。为了验证mRNA的降低是否由无义介导的mRNA降解（Nonsense-mediated mRNA decay，NMD）导致，我们从Twin1和两个健康兄弟的PBMCs中提取RNA，逆转录为cDNA进行Sanger测序。结果显示，成熟mRNA中仅出现单个碱基替换，未出现核苷酸的缺失（图5）。
图4 FHL2在健康兄弟（II:5，II:6）和Twin1 PBMCs中的表达水平。
图5 PBMCs cDNA的Sanger测序。
基于既往报道和我们的临床经验，对于WM的家族易感性研究变得尤为重要。在本项工作中，我们报道了一个家族，其中一对双胞胎分别患WM和IgM-MGUS。IgM-MGUS是WM的早期无症状阶段，同时我们在随访中发现Twin2的IgM水平进行性升高，这意味着他极有可能发展为WM。
本研究中涉及的患者非常罕见，他们是同卵双生，具有高度相似的基因组特征。如果他们罹患一种类型疾病，那么极有可能存在遗传驱动因素，从而引导我们找到易感基因。评估WM家族的疾病状况对于阐明肿瘤发生的分子机制具有重要意义。
该案例中，患者的父母已经去世，父母的兄弟姐妹也难以取得联系，他们生活在WM被详细认知之前，预期寿命较低。对于许多患者来说，由于确诊年龄较晚，且疾病具有惰性，可能仍有大量的家族性WM病例未被发现。因此，我们认为WM的真实家族易感性可能比本研究中观察到的更高。
基于筛查标准和数据集分析，最有意义的家族性WM候选变异是FHL2g226a突变。然而，其他变异如MICALL1、CHST4和DOCK2突变，这些突变的共同作用也不能排除。
FHL2g226a突变此前从未被报道过。它需要在其他家族性WM人群中得到验证。FHL2是一种多功能连接蛋白，可与细胞表面受体、胞浆连接蛋白、结构蛋白、激酶和核转录因子相互作用。多种研究揭示了FHL2和一些信号通路间的相互关系，如与WM细胞相关的与WNT/β-catenin通路和ERK/MAPK通路。PPI分析显示FHL2还可能与IL-6及HCK相互作用，前期研究已证实IL-6、HCK在WM中具有显著的致病作用。
相关研究显示，FHL2可能是多种肿瘤中的癌基因或抑癌基因。 HL2在淋巴细胞白血病和Burkitt淋巴瘤中的低表达提示FHL2可能在淋系肿瘤中发挥抑癌作用。在本研究中，我们发现FHL2g226a突变可导致FHL2功能丧失，突变后FHL2表达降低可能与IgM-MGUS和WM的发生发展有关。 FHL2 mRNA表达降低提示了NMD的可能性，但对于cDNA的Sanger测序排除了这一可能。一种解释是点突变产生了一个新的起始密码子，另一种可能是microRNA的靶向结合抑制了mRNA的表达，其原因值得深究。
我们的研究结果表明，FHL2g226a突变可能在WM易感性中发挥重要作用。鉴定新的易感基因可能为WM发病的分子机制提供全新的见解。这也将为突变携带者的筛查和早期干预提供有价值的工具。
WM是一种罕见的B淋巴细胞肿瘤，患者会出现如贫血、疲劳和盗汗等临床表现。近年来，国际上对于WM发病机制、诊断治疗的研究均取得较大进展。随着医学进步，WM的治疗方案不断取得突破，已从传统的免疫化疗发展到靶向药物治疗时代，大部分患者的生存期已可延长至十年以上。
由于存在不同的临床表现和疾病的罕见性，WM的一线治疗选择具有广泛的异质性。靶向药物BTK（布鲁顿氏酪氨酸激酶）抑制剂应用在治疗不同基因型与治疗状态的华氏巨球蛋白血症患者中均可取得深度缓解。在2020年底更新的美国NCCN指南中，对于初治和难治或复发的华氏巨球蛋白血症患者，伊布替尼是指南推荐的治疗方案。
伊布替尼作为国内首个获批的口服BTK抑制剂，在2018年获批用于治疗华氏巨球蛋白血症，且该适应症的治疗方案也于2020年被正式纳入国家医保目录，药价降幅可达85%。 随着今年3月新版国家医保目录正式落地，伊布替尼的纳入，拓宽了患者的用药选择，有效降低了患者负担。
这期淋巴瘤微课就到这里，谢谢大家！
Yike Wan, Yuexin Cheng, Yabin Liu, Lijing Shen, Jian Hou. Screening and identification of a novel FHL2 mutation by whole exome sequencing in twins with familial Waldenström macroglobulinemia. Cancer 2021;0:1-10.
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