目前，靶向治疗药物的出现极大改善了驱动基因阳性晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的预后，而晚期NSCLC常规检测的靶点包括EGFR、ALK、ROS1以及MET等。其中，ALK突变又被成为钻石突变，在接受ALK-TKI治疗后患者预后明显改善。本文就ALK突变进行细致解读，相关文献发表在近期的Lung Cancer杂志。
背景
自2007年在NSCLC中发现间变性淋巴瘤激酶（ALK）重排以来，ALK+ NSCLC诊疗进步迅速，目前全球范围内已有克唑替尼、阿来替尼、塞瑞替尼、布加替尼（Brigatinib）、恩沙替尼和劳拉替尼（Lorlatinib）6种ALK-TKI获批上市。值得强调的是，ALK-TIK治疗的进步依赖于ALK+ NSCLC检测水平的进步，最初获批应用较广的荧光原位杂交（FISH）和免疫组织化学（IHC）并不能识别融合伴侣和融合断点。随着二代测序（NGS）的日益普及，目前NSCLC中有90余种ALK融合伴侣被发现。尽管在ALK+ NSCLC中有多种融合伴侣被发现，EML4-ALK仍是ALK+ NSCLC最常见的融合变体，约占85%。
NSCLC中的EML4-ALK变体
EML4位于染色体2p21，包含26个外显子。迄今为止，ALK+ NSCLC已经有EML4外显子2、3、6、7、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21和23被发现存在融合断点。EML4-ALK融合变体的命名是根据变体被发现的时间顺序，而非EML4基因的外显子断点。变体“编号”的模式和域，详见图1A，各亚型对抑制剂的耐药性略有差异。
图1. （A）各种“编号”EML4-ALK变体的结构域和融合断点示意图、（B）从2个独立测序数据库汇总的1387个EML4-ALK变体在EML4-ALK+ NSCLC中的分布
从本质上讲，EML4蛋白是由一个N端卷曲螺旋三聚化结构域和串联非典型β-螺旋桨结构域（TAPE）组成。EML4-ALK变体可大致分为“短”（不包含TAPE域的v3a/b和v5a/b），以及包含部分TAPE域的“长”变体，最终导致细胞蛋白稳定性和ALK-TKI临床疗效上不同程度的差异。EML4-ALK v1（E13，A20）和EML4-ALK v3a/b（E6，A20），这2种EML4-ALK变体类型占据所有EML4-ALK变体的70%~80%，其次常见的突变类型是EML4-ALK v2和EML4-ALK v5'，详见图1B。
“长”、“短”变体之间最主要的生物学差异之一是蛋白稳定性，最终转化为对ALK-TKI治疗的不同反应。既往研究显示，在Ba/F3细胞系模型中，相比于EML4-ALK v2亚型，EML4-ALK v3亚型具有最持久的蛋白稳定性和对克唑替尼或HSP90抑制剂、17-DMAG以及AUY922最低的敏感性。类似试验还表明，“长”变体EML4-ALK v1和v2亚型容易受到HSP90抑制剂Ganetespib的抑制，而“短”变体EML4-ALK v3和v5亚型则不然。
三代6种ALK-TKI各有千秋，EML4-ALK v1和v3临床特性大不同，疗效差异应关注
Horn教授和Lovy教授及其团队详细比较了目前上市的克唑替尼、阿来替尼、塞瑞替尼、布加替尼、恩沙替尼和劳拉替尼6种ALK-TKI，对2种主要野生型EML4-ALK变体亚型v1和v3的IC50值，结果如图2A所示。相比于v3变体亚型，6种ALK-TKI对EML4-ALK v1变体亚型的IC50值均较低，表明v3变体亚型存在相对且统一的“抵抗”固有模式，结果如图2B所示。v3/v1的抑制活性比方面，阿来替尼的比率最大，为21.43，布加替尼、恩沙替尼和劳拉替尼分别为17.47、19.45和16.69。在6种ALK-TKI中，劳拉替尼对2种亚型均显示出绝对最低的IC50值，如图2A所示。尽管相对于v1，劳拉替尼对v3的IC50值增加了16.69倍，但劳拉替尼依然为针对EML4-ALK v3亚型最有效的抑制剂。上述结果表明，在EML4-ALK v3亚型患者中，应该考虑在病程更早期就引入更积极的治疗。
图2. （A）所有6种获批ALK-TKI对野生型EML4-ALK v1和v3的临床前IC50值比较、（B）对野生型EML4-ALK v3/v1的IC50比
Horn教授和Lovy教授还对6种ALK-TKI对不同获得性ALK耐药突变的细胞抑制活性进行了全面分析，结果显示，不论EML4-ALK v1或v3变体亚型如何，大多数耐药突变都显示出相似的耐药水平（IC50值），但也有一些例外。例如，对于ALK G1202R突变患者，布加替尼和劳拉替尼在v1亚型背景下似乎具有相似的临床前效力，但在v3变亚型背景下，布加替尼的效力降低，而劳拉替尼效力基本不变，如图3A所示。对于ALK G1202del突变患者，布加替尼和劳拉替尼在v1亚型背景下IC50值更高，尤其是劳拉替尼，如图3B所示。对于ALK L1198F和ALK G1269A突变患者，布加替尼和劳拉替尼在v1亚型背景下表现出较低的IC50值，而在v3亚型背景下表现出更高的IC50值，尤其是布加替尼，如图3C和D所示。上述结果提示，在解释ALK耐药突变时，应充分考虑融合变体的背景。
图3. 布加替尼和劳拉替尼对4种克唑替尼耐药突变（A）G1202R、（B）G1202del、（C）L1198F、（D）G1269A的临床前IC50
2016年Yoshida及其同事率先开展回顾性分析，评估EML4-ALK不同变体对克唑替尼的疗效。v1亚型患者相比于非v1亚型患者，应用克唑替尼的总体客观反应率（ORR，74% vs 63%）和疾病控制率（DCR，95% vs 63%）更高，中位无进展生存期（PFS，11m vs 4.2m）更长（P<0.05）。后续多项回顾性研究均证实了上述研究结果，并将v1和v3亚型的疗效差异扩展到第二代ALK-TKI以及“短”、“长”EML4-ALK变体亚型。
在eXalt2单臂临床试验中，分析了76例参加恩沙替尼Ⅰ/Ⅱ期试验的ALK+ NSCLC患者，其中56例有血浆循环肿瘤DNA（ctDNA）数据。患者为TKI初治，或既往接受过克唑替尼治疗，或既往接受过克唑替尼+至少1种二代 ALK-TKI治疗的患者。EML4-ALK v1亚型和v3亚型患者的ORR分别为53%和14%，在仅接受克唑替尼治疗的患者中，两种亚型患者的ORR分别为78%和25%。在所有患者中，v1亚型患者的中位PFS为8.2个月，而v3亚型仅为1.9个月。对于仅接受克唑替尼治疗的患者，v1亚型患者的中位PFS为10.9个月，而v3亚型仅为2.2个月。上述结果初步表明，相比于EML4-ALK v3亚型患者，EML4-ALK v1亚型患者从ALK-TKI治疗中获益更多，疗效更好。
在PROFILE1014、ASCEND-4、ALEX、ALTA-1L、eXalt3、CROWN这六项全球随机Ⅲ期试验，以及PROFILE10129、J-ALEX、ALESIA这三项国家或地区级别随机Ⅲ期临床试验中，ALEX和ALTA-1L临床试验均对不同EML4-ALK突变亚型患者的ORR和PFS结果进行了总结，如下表所示。值得注意的是，只有J-ALEX研究允许通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）或IHC和FISH组合检测符合入组临床试验标准，其余试验入组标准均根据IHC或FISH结果。ALEX临床研究显示，通过组织或血浆基因检测，v1亚型患者接受阿来替尼治疗后的ORR数值上高于v3变异组。基于血浆基因检测结果，阿来替尼治疗可以使v1亚型患者的中位PFS比v3亚型的延长接近2倍（34.8个月 vs 17.7个月）。基于组织基因检测结果，接受阿来替尼治疗的v1亚型患者的中位PFS尚未达到，而v3亚型患者的中位PFS为34.9个月。
有研究发现，最常见的ALK耐药突变ALK G1202R在v3亚型背景下更为常见（100%）。因此，EML4-ALK v3的检测不仅提醒临床医生应注意下一代ALK-TKI带来的潜在较短PFS，而且还应注意出现高度耐药性ALK突变的可能性更高。此外，EML4-ALK v3亚型可能预示着更高的肿瘤负荷。
表1. ALK-TKI一线治疗Ⅲ期研究的ORR和PFS
ALK+ NSCLC中的TP53共突变
TP53突变会破坏p53蛋白的肿瘤抑制功能，TP53突变几乎在包括ALK+ NSCLC在内的所有癌种中均能检测到，并且是最常见的基因突变类型之一。在EGFR+和ALK+这2种典型的驱动基因阳性NSCLC中，TP53突变是PFS和OS的不良预后因素，TP53突变与更短的PFS密切相关。ALK+ NSCLC中，TP53+与TP53-之间的临床病理特征仅存在吸烟状况差异（TP53-中从不吸烟者为79.6%，TP53+中为46.7%，P=0.021），而在性别、年龄、组织学类型、分期以及PS评分方面并无明显差异（P>0.05）。在v1、v2和v3不同亚型中，TP53+的百分比并没有明显差异。既往一项研究发现，在接受克唑替尼治疗后，TP53+患者的肝转移发生率（41.2%）高于TP53-患者（13.4%，P<0.001），多因素分析显示，较高的肿瘤负荷是患者的不良预后因素。此外，TP53+患者在克唑替尼治疗后、恩沙替尼治疗前以及恩沙替尼治疗进展后有更高的肿瘤突变负荷。因此，以往研究观察到的TP53突变状态的临床疗效和生存结果差异，可能与临床病理特征无关，而可能取决于分析TP53突变状态时的治疗线数。
ALTA-1L研究根据TP53突变状态进行了ORR和PFS分析，接受布加替尼治疗的TP53野生型（TP53wt）和突变型（TP53mt）患者的ORR分别为91%和79%，中位PFS分别为24个月和8个月。目前，多项临床研究均表明，TP53突变或EML4-ALK v3亚型ALK+ NSCLC患者预后相对较差，同时携带TP53突变和v3亚型的患者预后更差。Christopoulos及其同事对102例Ⅳ期ALK+ NSCLC患者进行回顾性研究发现，TP53突变和EML4-ALK v3亚型与诊断时更多的转移灶数量和TKI治疗后更短的中位PFS独立相关。在这项研究中，v3亚型患者的中位PFS为7个月，不到v1/v2亚型患者（16个月）中位PFS的一半，双重突变（EML4-ALK v3/TP53mt）患者的中位PFS更短。此外，与v3亚型患者（HR=2.4）相比，TP53突变患者（HR=4.9）的OS更差，双重突变患者（HR=9.1）具有累加效应。上述结果提示，TP53mt患者可能需要更积极的治疗，诸如化疗和ALK-TKI的前期联合治疗等，这是未来值得进一步探索的领域之一。
根据EML4-ALK变体和TP53突变状态，优化ALK+ NSCLC的管理
无论是化疗、一代、二代或三代ALK-TKI治疗，具有“长”EML4-ALK突变和野生型TP53的ALK+ NSCLC患者都有望获得最佳OS结果。血浆检测数据表明，对于EML4-ALK v1亚型患者，阿来替尼的中位PFS为34.8个月，布加替尼尚未达到中位PFS。基于劳拉替尼的临床前研究和CROWN研究结果，对于EML4-ALK v1亚型患者，劳拉替尼的IC50值最低，推荐不论EML4-ALK突变亚型如何，一线治疗首选劳拉替尼，然而，目前关于劳拉替尼是否应该成为晚期ALK+ NSCLC首选一线治疗仍存在争论。在因ALK耐药突变而导致疾病进展时，后续最佳治疗选择依赖于突变状态和第四代ALK-TKI的相关临床试验数据。对于因脱靶耐药机制而导致的疾病进展，HSP90抑制剂和ALK-TKI的组合有望成为一种新的治疗选择。从目前所有回顾性研究来看，EML4-ALK v3亚型似乎预示着更短的PFS，并且更有可能产生顽固的ALK G1202R突变。从Horn教授和Lovy教授的相关研究以及CROWN临床研究看，劳拉替尼是EML4-ALK v3亚型的最佳ALK-TKI，可以避免产生ALK G1202R和复合ALK突变。
TP53突变与EML4-ALK突变无关，在ALK突变合并TP53突变的背景下，探索各种ALK-TKI的IC50值研究尚未完成。前期临床研究表明，即便存在TP53突变，最有效的ALK-TKI是劳拉替尼，因此目前建议劳拉替尼作为ALK+ NSCLC的首选一线治疗。在ALK-TKI进展后，Tanimoto教授最新研究结果表明，与ALK-TKI协同发挥作用的蛋白酶抑制剂或可提供不依赖于TP53的细胞凋亡作用。合并TP53mt的EML4-ALK v1亚型患者的中位PFS约为7.4个月（95%CI：1.1-未达到），而EML4-ALKv1/TP53wt患者中位PFS尚未达到。在更多临床数据出现之前，可以认为TP53突变的治疗方法不应依赖于EML4-ALK突变状态。
结论
不同EML4-ALK突变亚型对ALK-TKI会产生不同的临床疗效和预后，“短”突变预后较差，在高肿瘤负荷的情况下，这种影响更明显。
TP53突变是ALK+ NSCLC最常见的基因组改变和不良预后因素。临床前数据表明，ALK-TKI与蛋白酶抑制剂组合可能有助于产生不依赖于TP53的细胞凋亡。
克服双重ALK突变的第四代ALK-TKI TPX-0131于2021年开始首次人体临床试验，2022年另一个第四代ALK-TKI NVL-655也将开展临床试验。
未来，ALK+ NSCLC临床试验应考虑潜在的EML4-ALK变体，无论是作为正式的分层因素还是根据潜在的EML4-ALK变体（v1、v2、v3、v5或“长”与“短”）来解释临床疗效。
精准治疗，检测先行。
Zhang SS, Nagasaka M, Zhu VW, Ou SI. Going beneath the tip of the iceberg. Identifying and understanding EML4-ALK variants and TP53 mutations to optimize treatment of ALK fusion positive (ALK+) NSCLC. Lung Cancer. 2021 Jun 12;158:126-136.
排版编辑：MJ
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