结直肠癌分子标志物检测的适应症与时机
肿瘤组织样本又可根据其来源分为原发灶样本和转移灶样本。对于结直肠癌相关 KRAS、NRAS和BRAF基因的突变，在原发灶样本和转移灶样本中的一致性非常高
外周血有核细胞标本能明确反映胚系突变情况，可用于遗传性患者的诊断。但外周血有核细胞不能反映肿瘤组织的体细胞突变，无法帮助临床预测相关药物的治疗效果。外周血有核细胞标本基因检测时要注意CTC可能带来的干扰
专家意见1：对于所有mCRC患者，均推荐在综合治疗前行常规分子标志物检测（RAS基因突变、BRAF基因突变、MSI状态/MMR蛋白表达），根据结果制定个体化治疗方案；推荐对于所有临床怀疑林奇综合征的患者，检测MSI状态/MMR蛋白表达进行遗传筛查。
40%~50%的结直肠癌患者存在KRAS 点突变；3.8% 的结直肠癌存在 NRAS 基因点突变
BRAF基因作为RAF原癌基因家族的成员，位于 RAS 基因下游，是 RAS⁃RAF⁃MEK 激酶通路上的关键成员。在亚洲结直肠癌患者中，BRAF 突变率为5.4%~6.7%。
另有研究显示，BRAF 基因突变的转移性结直肠癌患者中，90%为BRAF V600E突变，BRAF V600E突变患者相比其他患者预后更差，生存时间更短
对于林奇综合征的诊断，MLH1突变患者必须加做MLH1甲基化或BRAF V600E突变检测，如有BRAF V600E突变则不能确诊为林奇综合征。因此，推荐在结直肠癌患者中进行BRAF V600E突变检测，可用于选择个体化治疗方案、帮助林奇综合征的诊断以及患者的预后判断
对于MSI检测，目前主要以多重荧光PCR毛细管电泳技术为主。对相关细胞DNA微卫星的长度改变来决定MSI状况。根据微卫星的不同状况可将患者分为3种，即：高度微卫星不稳定（MSI⁃H）、低度微卫星不稳定（MSI⁃L）和微卫星稳定（micro⁃satellite stable，MSS）。通常采用美国国家癌症研究所推荐的5个微卫星位点进行检测，当≥2个微卫星位点显示MSI，即可诊断为MSI⁃H；1个显示MSI，可诊断为MSI⁃L；没有任何位点显示MSI，即MSS。MMR蛋白的IHC检测，需同时检测4个常见MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）的表达。其中≥1 种表达缺失，判定为错配修复基因缺陷（dMMR）；全部阳性，则判定为错配修复基因完整（pMMR）。一般而言，dMMR相当于MSI⁃H，pMMR相当于MSI⁃L或MSS
MSI⁃H状态的Ⅱ期和Ⅲ期结直肠癌患者，其预后一般优于MSS患者。MSI⁃H的Ⅱ期患者，一般预后较好，且不能从氟尿嘧啶（5⁃FU）类单药化疗中获益，所以建议Ⅱ期患者术后常规进行MSI检测。此外，转移性MSI⁃H/dMMR患者对于免疫检查点抑制剂疗效较好
KEYNOTE⁃177 研究表明，MSI⁃H/dMMR 患者姑息一线应用帕博利珠单抗，客观缓解率为43.8%，而标准化疗靶向组显著较低，为33.1%。MSI/MMR状态对于遗传性结直肠癌的诊断也具有较大的意义，尤其是林奇综合征的诊断，MMR基因的胚系突变是确诊的金标准。
专家意见2：对于经标准治疗失败的mCRC患者，可进行Her⁃2扩增/过表达和NTRK基因融合的检测；PIK3CA突变检测和TMB检测仅限研究使用。
Her⁃2：
Her⁃2是EGFR基因家族成员，其作为结直肠癌的原癌基因之一，可通过激活RAS⁃RAF⁃MEK和PI3K⁃AKT⁃mTOR 通路，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤新生血管形成。结直肠癌中Her⁃2扩增/过表达的总体发生率约为5%，与KRAS、NRAS和BRAF突变存在相互排斥，且在原发肿瘤与转移瘤之间高度一致。推荐对于经标准治疗失败后的mCRC患者可进行Her⁃2扩增/过表达的检测
NTRK基因融合：
NTRK基因融合在结直肠癌中比较罕见，发生率为0.35%。NTRK抑制剂仅对携带NTRK融合的患者有效，而对突变患者无效。IHC是一种有效，快速的初筛方法，IHC阳性的肿瘤需使用FISH、PCR或NGS方法进一步验证。由于NTRK基因融合发生率极低，目前仅推荐在标准治疗失败后、或者筛选临床研究的患者中进行检测
PIK3CA 突变：
在中国人群中 PIK3CA 突变率仅为3.5%，与RAS信号通路共同构成EGFR下游两条平行通路。与 RAS 和 BRAF 基因突变的排他性不同，PIK3CA 突变可与RAS 突变共同存在。根据部分已有的研究结果，PIK3CA 突变可能是对阿司匹林治疗有效的预测标志物，但各研究之间尚缺乏较好的一致性。此外，由于PIK3CA突变与抗EGFR单抗疗效的相关性目前尚不能完全确定，因此，目前尚不推荐对结直肠癌患者常规行PIK3CA突变检测。
TMB：
TMB是肿瘤组织DNA中基因组突变数的指数，它是测量肿瘤体细胞内编码蛋白的平均1Mb范围内的碱基突变数量，包括基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失等各种形式的突变。FDA于2020年6月批准了免疫检查点抑制剂用于治疗高肿瘤突变负荷（TMB⁃H≥10个突变/兆碱基）的无法切除或转移性实体瘤的成年和儿童患者。目前在结直肠癌中尚不推荐常规行TMB检测。
专家意见 3：对于临床上怀疑诊断家族性息肉病、林奇综合征和P⁃J综合征等家族遗传性疾病者，推荐行相关遗传易感性基因的胚系突变检测。
与结直肠癌遗传易感性相关的基因包括APC、MMR和STK⁃11等基因。其中，APC 基因的突变和家族性腺瘤性息肉病（familialadenomatous polyps，FAP）有关，其基因型和临床表型存在相关性，即碱基突变的位置和息肉发生的严重程度有关。如怀疑 FAP 而 APC 基因无突变者，还需要进一步检测MUTYH基因突变。遗传性非息肉病性结直肠癌（林奇综合症）是一种常染色体显性遗传性疾病，其发病与 MMR 基因的胚系突变有关。MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2 是最常见发生突变的 4 个 MMR。大约 70% 的林奇综合征患者是由 MSH2 和 MLH1 突变所致，其余 30% 多由 MSH6 和 PMS2突变所致。
专家意见 4：对于结直肠癌患者，推荐对经手术切除或活检的原发灶或转移灶组织标本行相关分子标志物的蛋白表达水平检测，以帮助判定肿瘤来源和类型。
专家意见5：临床医师在开展结直肠癌分子标志物检测时，应充分了解各检测方法的性能，推荐临床加强基因检测报告中样本类型、检测方法、突变类型等部分的关注和解读。推荐NGS在获得认证的平台和技术、严格的质控、规范的操作流程的基础上进行运用。
NGS检测结果证据等级：在文献综述基础上，建议将肿瘤体细胞基因变异根据证据等级分为4类：
Ⅰ类变异：明确临床意义的变异，A 级证据是由 FDA、国家药品监督管理局批准，或来自专业临床指南，B级证据是由临床研究证实，且取得领域专家共识；
Ⅱ类变异：潜在临床意义的变异，C 级证据是由 FDA、国家药品监督管理局批准的不同肿瘤类型的疗法或试验性疗法、多项小型已发表研究达成的共识，D级证据是临床前研究或少数病例报告，还未达成共识；
Ⅲ类变异：临床意义未明的变异，在一般或特定亚组数据库、泛癌种、肿瘤特异性变异数据库中未观察到显著的定位基因发生频率，还没有已发表的可信的与癌症相关的证据；
Ⅳ类变异：良性或可能良性变异，在一般或特定亚群数据库中观察到显著等位基因发生频率。目前尚无已发表的癌症相关性证据。在NGS测序中，主要检测单核苷酸变异、插入缺失变异和基因融合等，参数调整后可分析基因拷贝数变异，根据相应变异结果，判读相应基因变异所表明的临床意义。
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中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌专家委员会.结直肠癌分子标志物临床检测中国专家共识[J].中华胃肠外科杂志,2021,24(3):191-197.
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