编译作者:钠镁
背景&目的
Vater壶腹癌是一种发病率低于1/10万的罕见性、高度恶性肿瘤。2010年才作为独立的疾病被进行分类,疾病的概念不甚明确,手术、内镜切除以外的标准治疗方法也没有确立。目前已知局限于壶腹部的壶腹癌5年生存率(45%)明显高于向周围组织浸润者(31%),或远处转移者(4%)(远处淋巴结转移或内脏器官转移)。
三种不同的上皮层(十二指肠、胆道、胰腺)汇集于Vater壶腹,胰腺和胆管上皮细胞融合在Vater壶腹部形成壶腹上皮。壶腹癌可分为两种组织学表型--肠型或胰胆管型,不同表型有着不同的病理和临床特征。在多数研究中,胰胆管癌比其它亚型恶性度更高。几项研究表明伴有肠型分化的壶腹癌对不同的化疗方案的反应比伴有胆管分化的壶腹癌更敏感。
然而目前基于亚型分类的壶腹癌的分子遗传学机制研究甚少,且因该肿瘤罕见大规模收集样本比较困难。为分析壶腹癌的体细胞突变,本文研究者们通过国际多中心合作,通过外显子组测序、DNA拷贝数分析、靶基因测序等方法对其进行基因异常的深度分析以探究该疾病潜在治疗机制。
壶腹癌示意图
结果
➢发现了壶腹癌中特征性的ELF3基因突变,功能解析提示ELF3是与该肿瘤的运动能和浸润能相关的抑癌基因
对60例壶腹癌、10例十二指肠癌进行外显子组测序和DNA拷贝数分析,发现了壶腹癌中显著突变的驱动基因,包括KRAS、TP53、APC、ELF3、SMAD4、 CTNNB1和 MUC4;其中ELF3为壶腹癌特征性突变。继而筛选了92个高频突变或已知与临床相关的基因,追加了112例壶腹癌、8例十二指肠癌进行靶基因测序以验证有意义的突变。172例壶腹癌的外显子组及靶基因测序的结果,认定了24个与癌症发生、进展相关的驱动基因。其中包括KRAS、TP53、APC等常见的癌基因、抑癌基因,及迄今为止基本未被报道的基因ELF3--被认定为是第6个与壶腹癌相关的特异性基因。
而且,研究者们发现潜在的治疗靶向突变--ERBB2、ERBB3、BRAF、BRCA2、PIK3CA和其它基因,存在于51%(88/172)的壶腹癌患者中。在这些明显突变的基因中,日本与美国患者没有表现出明显的不同。
ELF3的基因突变模式
壶腹癌中特征性基因突变前10位
ELF3是由371个氨基酸组成的基因,在壶腹癌中发现该基因的多种突变,其中多数(17/25, 68%)为蛋白质短缩这样的有害基因突变,被认为是抑癌基因。
进而用正常的胆管细胞株或十二指肠细胞株进行实验,观察到抑制ELF3基因可增强细胞的运动能和浸润能,增强与癌症浸润、转移相关基因(MMP1,MMP9)的表达,引发上皮间质转化相关基因的表达改变。
而且,ELF3基因突变在日美患者中几乎检出频率相同,说明这是无人种差别的共同的基因组异常。
➢基于组织形态学的分类解析的结果,发现肠型与大肠癌之间,胰胆管型与胰腺癌之间有相似的基因组异常
肠型壶腹癌与大肠癌按APC,TP53,KRAS,SMAD4的顺序;胰胆管型壶腹癌与胰腺癌按KRAS,TP53,SMAD4的顺序,可观察到基因突变。肠型与胰胆管型相比,APC,ACVR2A,SOX9和EPHA6基因在肠型中显著突变;而KRAS,TP53和CDH10在胰胆管型中显著突变。其中,本研究新认定的ELF3基因的突变频率,在肠型和胰胆管型基本相同。以上提示基于亚型分类的治疗分层化是可能的。
肠型壶腹癌与大肠癌,胰胆管型壶腹癌与胰腺癌中的高频突变基因
➢体细胞拷贝数改变情况
对58例壶腹癌和10例十二指肠癌进行外显子组测序,行体细胞拷贝数改变分析(SCNAs),发现了SCNAs可以解释驱动致癌性。4个区域有明显的局部扩增--8q24.21(包括MYC),12q15(包括MDM2),3q26.2(包括PRKCI和SKIL)和1p31.1(包括NEGR1)和2个明显的局部删除--9p21.3(包括CDKN2A)和18q21.2(包括SMAD4)。
➢改变的信号通路
研究者们依据组织学表型给标本分组,并且发现了在Wnt、TGFβ、PI3K、RTK-RAS和P53-Rb信号通路上的改变。
➢用十二指肠乳头部癌的组织切片绘制基因变异地图,证实了肿瘤基因组的异质性与肿瘤的“进化”
基因突变在同一患者(同一肿瘤)中,自癌症发生到治疗期间,抗肿瘤药无效产生耐药性,被认为是多个基因异常一边蓄积,一边发生变化的过程。该过程被认为遵循达尔文的理论,是癌细胞竞争性地适者生存,不适者自然被淘汰的“进化”。
该研究在壶腹癌中采取全新的组织分取技术Glass Chip Macrodissection(GCM)进行多区域外显子组测序,开发了癌症基因组多样性的正确解析手法,以解释肿瘤的异质性和该病的发癌过程。以经病理组织学确认具有多样性的病例为例,从癌前病变腺瘤到粘膜内癌和肿瘤最深处的浸润部进行基因组解析,其异质性证明了癌症的“进化”。
图A:肠型壶腹癌的一例组织切片示意图(H&E染色)。根据病理形态学,该切片是经历了从癌前病变低级别上皮内瘤样病变(即肠型腺瘤)到高级别上皮内瘤样病变(即粘膜内癌)的过程,观察到正向着浸润癌进展的形态(三种组织形态兼具)。
图B: 该组织切片运用Olympus公司新开发的组织分取法(GCM)技术,整个切片被切分为32个1mm2/单元的小块(厚度,18mm)。用5个连续切片从相同的部位分别抽取gDNA,继而进行外显子组测序解析。
图C: 癌症的进展过程是癌细胞增殖速度加快而产生偶然(二次)突变。考虑到该偶然现象的发生,基于氨基酸不发生改变(synonymous)的突变的测序数据绘制成进化树。向右推进,伴随着时间推移克隆渐渐分化,产生了其它克隆(亚克隆)。
图D: 进一步将图C的进化树简略,加上有氨基酸改变的突变(nonsynonymous)的驱动基因(已知与癌症发生和癌症恶性化直接相关的基因)变异,作成了进化模型。
图E: 用颜色区分与图C来源相同的肿瘤克隆,图B染色后即为图E。相同颜色表示肿瘤克隆相近。注:黑色区域采取的DNA量不足,故无法进行外显子组测序解析。
以上的结果显示,分析的肠型壶腹癌低~高级别上皮内瘤样病变(腺瘤-粘膜内癌)各组分稳定地进展,占据组织切片的大部分,它们有相同的驱动基因变异(APC基因、KRAS基因等)。只有在肿瘤的最深部癌症的浸润部(图E,27号区域:红色),可观察到驱动基因ATM、FBXW7基因变异的蓄积。
这些基因突变影响癌症的浸润,有这些变异的克隆,临床上成为与淋巴结转移或远隔转移相关的优势克隆。ATM突变成为PARP抑制剂等分子靶向药物的靶点,虽然现阶段可能是次要的肿瘤克隆,但再发、转移治疗的时候把握该变异很重要。
结论
●作为罕见性癌的壶腹癌(Vater壶腹癌),通过日美的国际合作进行大规模的基因组解读。从基因组异常的观点来看,是世界上首次对壶腹癌的病因解明。
●解明了壶腹癌的基因组异常,发现了特征性的癌症相关基因ELF3。明确了ELF3与肿瘤的运动能、浸润能相关。
●基于组织、形态学的亚型分类解析的结果,发现了肠型与大肠癌、胰胆型与胰腺癌之间有相似的基因组异常。
●壶腹癌大约半数可检出作为治疗靶点的基因异常,因此期待个体化治疗的应用。
●壶腹癌癌同一肿瘤内的癌症基因组异质性可被证实为“进化”。
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来源:Genomic Sequencing Identifies ELF3 as a Driver of Ampullary Carcinoma.ARTICLE in CANCER CELL.JANUARY 2016 Impact Factor: 23.52.DOI: 10.1016/j.ccell.2015.12.012.