同源框B9 （HOXB9）参与恶性肿瘤的发生发展。然而，HOXB9在胰腺癌中的作用和潜在的分子机制尚未明确。近日，来自中国哈尔滨市哈尔滨医科大学附属肿瘤医院的张艳桥教授团队发表在《肿瘤通讯》（Cancer Letter）上一篇题为HOXB9 blocks cell cycle progression to inhibit pancreatic cancer cell proliferation through the DNMT1/RBL2 /c-Myc axis的文章，表明胰腺癌中HOXB9或许起着不同于在其他肿瘤中的肿瘤抑制功能。这一结果非同凡响，【肿瘤资讯】带您一起探索其中奥秘！
研究背景
近年来，胰腺癌的死亡率在所有类型的肿瘤中排名第三，5年总生存率低于10%。据统计，2021年有超过六万例胰腺癌新发病例确诊。手术是目前治疗胰腺癌的唯一方法，然而由于病程进展迅速，大多数患者在确诊时已进展到晚期。即使CA199已被作为预后生物标志物在胰腺癌中广泛应用，但依然缺乏敏感性和特异性。因此，胰腺癌患者的临床需求原未被满足，亟待新型诊疗手段。
HOXB9是一种参与细胞增殖和分化的转录因子。既往研究表明，HOXB9通过促进细胞增殖、血管生成、侵袭和转移，参与肿瘤的发生和进展。高水平的HOXB9也被认为是乳腺癌、肺癌和前列腺癌不良预后标志。然而，HOXB9在预测预后和影响胰腺癌进展方面的作用尚不清楚。本研究深入探索了HOXB9及其下游通路在胰腺癌中的调节作用和内在机制，提供了一种潜在的新型标志物。
研究方法
该研究中随机收集了150例胰腺癌患者的肿瘤组织石蜡切片；这些患者均在2012年1月至2014年12月期间于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院就诊并接受手术。此外，该研究还收集了3名胰腺癌患者的新鲜肿瘤组织作为裸鼠皮下移植瘤模型的植入样本。
研究采用免疫组化和RT-qPCR等检测方法，分析了纳入样本中的HOXB9表达水平，并与正常组织样本进行了比较；同时根据患者的随访结果，评估HOXB9对预后的影响。为在分子层面验证HOXB9的功能及其调控机制，研究者采用了胰腺癌细胞系及正常胰腺细胞系，比较了HOXB9的表达；并构建了基于裸鼠的动物模型，通过调控HOXB9和相关基因的水平，评估HOXB9及其下游通路对胰腺癌发生发展的影响。
该研究通过分析肿瘤基因组图谱（TCGA）、 WebGestalt工具和GSEA数据库对HOXB9进行功能富集分析，筛选HOXB9的下游通路。通过在胰腺癌细胞系中，转染HOXB9过表达质粒（pHOXB9）和两种HOXB9特异性短发夹RNA （shHOXB9-1和shHOXB9-2）来过表达或敲除HOXB9。采用CCK8、EdU检测以及集落形成试验等方法评估胰腺癌细胞的增殖能力；采用划痕试验、流式细胞术等检测方法评估胰腺癌细胞的侵袭、迁移及自噬能力，并鉴定细胞周期。
研究结果
1. HOXB9在胰腺癌组织中表达下调，并与胰腺癌患者预后相关
免疫组化和RT-qPCR检测的结果显示，胰腺癌组织中HOXB9蛋白及mRNA表达水平均低于相应的正常部位非肿瘤组织。基于人类胰腺癌细胞系和正常胰腺上皮细胞（HPDE6-C7）的分析也确证，HOXB9的mRNA和蛋白表达水平均在胰腺癌中显著下调。
150例患者的HOXB9表达水平与胰腺癌临床病理参数之间的相关性分析显示， HOXB9过表达与肿瘤T分期低呈正相关（P = 0.012）。Kaplan-Meier生存分析显示，HOXB9低表达的胰腺癌患者中位总生存（OS）时间显著短于高表达患者（P < 0.001）。以上结果说明，HOXB9在胰腺癌组织中显著低表达，且HOXB9水平低提示胰腺癌患者预后不良。
图1 HOXB9在胰腺癌组织和细胞系中表达下调
2. HOXB9在体内外均能抑制胰腺癌细胞增殖
胰腺癌细胞系Panc1和Capan1在接受转染后，实现了HOXB9过表达或敲除。CCK8、集落形成试验以及EdU检测表明，过表达HOXB9后，Panc1和Capan1细胞的生长速率、菌落生成数量和增殖能力均显著下降。相应的，敲低HOXB9可促进胰腺癌细胞增殖。以上结果表明，HOXB9可以抑制胰腺癌细胞在体外的增殖。然而，HOXB9的迁移、侵袭、自噬和凋亡水平则没有受到HOXB9表达水平的显著影响。
为进一步评估HOXB9的影响，本研究通过在裸鼠皮下注射胰腺癌细胞，构建了HOXB9病毒（LV-NC或LVHOXB9）稳定感染或不稳定感染的裸鼠皮下移植瘤模型。结果显示，与对照组相比，HOXB9高表达组的移植瘤生长速率明显下降。综上所述，HOXB9在体外和体内均能抑制胰腺癌细胞的生长。
图2 HOXB9在体外抑制胰腺癌细胞的增殖
图3 HOXB9在体内抑制胰腺癌移植瘤的生长
3. HOXB9通过阻断细胞周期来抑制胰腺癌细胞的生长
生物信息学分析结果显示，HOXB9基因与视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma，Rb）基因在肿瘤和细胞周期中存在显著相关性，尤其与G1~S期的细胞周期控制相关。流式细胞术证实，HOXB9通过阻断细胞周期来介导对胰腺癌细胞增殖的影响。在Panc1和Capan1细胞中，与对照组相比，HOXB9过表达的细胞在细胞周期的G0/G1期显著受阻；在PSN1和PL45细胞系中，HOXB9基因的下调显著降低了G0/G1期比。此外，研究者还测试了HOXB9是否影响细胞进入有丝分裂的速率，发现在Capan1细胞中过表达HOXB9能够降低细胞进入有丝分裂的速率，而在PSN1中敲除HOXB9能够增加其进入有丝分裂的速率。
细胞周期关键调控因子的蛋白水平检测结果显示，HOXB9过表达显著降低了pRB、Cyclin D1和Cyclin E1的水平，但抑制细胞周期进展的蛋白P21的表达则有所升高。相比之下，HOXB9在PSN1和PL45中敲低后，蛋白表达趋势发生逆转。以上结果说明，HOXB9可将胰腺癌细胞周期阻滞在G0/G1期。
图4 HOXB9阻滞胰腺癌细胞的细胞周期
4. HOXB9通过上调RBL2水平抑制c-Myc表达，进而抑制胰腺癌细胞增殖
为阐明HOXB9阻断细胞周期的机制，该研究进行了细胞周期相关通路的荧光素酶报告检测，涉及Rb、NFκB、P53、WNT、STAT3和Myc。结果显示HOXB9过表达后，Rb和Myc水平下调，提示HOXB9可能通过影响Rb和Myc通路来阻滞细胞周期。细胞周期PCR-array实验被用于寻找HOXB9的靶基因，发现Panc1细胞系和Capan1细胞系均在HOXB9过表达时，出现RBL2水平的稳定上调。这一关联也被后续的蛋白质及mRNA表达水平检测确证。此外，细胞周期同步试验则显示，HOXB9和RBL2的表达水平不随细胞周期的进展而变化。
作为Myc途径的关键效应蛋白，c-Myc的表达在HOXB9被敲低时增加，在HOXB9过表达时降低。鉴于HOXB9在体内对RBL2和c-Myc均有调控作用，该研究进行了DNA序列分析和ChIP-qPCR，并证实HOXB9通过与胰腺癌细胞的启动子结合，促进RBL2的转录；并通过上调RBL2水平，抑制c-Myc表达。同时，通过检测接受不同转染的Panc1和Capan1细胞的增殖能力，该研究确定RBL2和c-Myc是HOXB9抑制胰腺癌细胞增殖的必需环节，即HOXB9通过上调RBL2来降低c-Myc水平，进而抑制胰腺癌细胞增殖。
图5 HOXB9通过调控RBL2和c-Myc的表达，抑制Rb和Myc通路活性
图6 敲低RBL2会削弱HOXB9抑制胰腺癌细胞增殖的能力
图7 c-Myc的下调部分逆转了shHOXB9对胰腺癌细胞增殖的影响
5. DNA甲基转移酶1 （DNMT1）介导的启动子高甲基化下调HOXB9的表达
为探索HOXB9表达的调节机制，该研究评估了其启动子在胰腺癌中的甲基化状态。TCGA数据库显示，胰腺癌中HOXB9的mRNA水平与其甲基化水平呈负相关；DNA甲基转移酶DNMT1的表达与HOXB9的表达呈负相关。DNMT1抑制剂硫鸟嘌呤（NSC 752）能够引起Panc1和Capan1细胞中HOXB9蛋白水平的剂量依赖性增加。DNMT1敲除也能促使HOXB9蛋白表达增加。人胰腺癌组织的免疫组化结果也显示了DNMT1表达与HOXB9呈负相关。
ChIP分析和MeDIP检测显示，DNMT1可以与HOXB9启动子区域结合。甲基化特异性PCR显示，DNMT1基因敲除后，胰腺癌细胞HOXB9启动子区CpG岛的甲基化状态发生逆转。DNMT1的小干扰RNA能够在G0/G1期抑制细胞增殖阻滞细胞周期，且这一现象能够被shHOXB9逆转。以上结果提示，HOXB9的下调与胰腺癌中DNMT1的高甲基化有关，DNMT1可以通过抑制HOXB9的表达来促进细胞周期进程。
图8 甲基转移酶DNMT1直接与HOXB9启动子结合，下调HOXB9在胰腺癌中的表达
图9 HOXB9通过DNMT1/HOXB9/RBL2/c-Myc轴阻断细胞周期，抑制胰腺癌细胞增殖
研究讨论
本研究发现HOXB9在胰腺癌中可作为肿瘤抑制基因。这与此前在结肠癌、胃癌中的发现一致，但与其在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中被作为不良预后标志、诱导多种促癌因子的功能恰恰相反。
研究者发现，HOXB9在胰腺癌组织中表达减少；HOXB9水平越高，预后越好。在机制上发现 DNMT1介导的启动子高甲基化是胰腺癌中HOXB9下调的原因。并通过体内和体外试验确证，HOXB9可以在转录水平上调RBL2的表达，抑制c-Myc通路的活性，从而实现在G0/G1期阻断细胞周期，最终抑制胰腺癌细胞增殖。因此，本研究揭示了DNMT1/HOXB9/RBL2/c-Myc通路是一种在表观遗传和细胞周期水平调控胰腺癌增殖的新机制，有望为其诊疗提供新思路；而HOXB9则有潜力被作为一种新的胰腺癌预后标志物。
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