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循环肿瘤DNA的检测方法（上篇）

03月10日

作者：金氪投行之家

来源：雪球

ctDNA仅占cfDNA的0.1%~5%，且不同癌种、不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中含量差异较大。因此，需要超敏感方法来检测ctDNA携带的特征信息（包括突变、重排、拷贝数异常、甲基化等）。本文将分上、中、下三篇详细介绍ctDNA的检测方法。上篇将介绍何为ctDNA，ctDNA的检测难度，ctDNA的检测流程，ctDNA的提取方法。

1. 何为ctDNA?

ctDNA（circulating tumor DNA，循环肿瘤DNA）是指人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征（包括突变、重排、拷贝数异常、甲基化等）来自肿瘤基因组的DNA片段。ctDNA的主要来源包括：来自坏死的肿瘤细胞；来自凋亡的肿瘤细胞；循环肿瘤细胞；来自肿瘤细胞分泌的外排体。

ctDNA的来源和携带的特征信息
资料来源：Nat Rev Cancer. 2017 Apr;17(4):223-238，宽华投研团队整理

目前，ctDNA的检测主要基于两种特征信息：突变和甲基化。突变检测在靶向药的敏感性和抗耐药性方面具有一定的优势，而甲基化检测在早期诊断、预后监测以及后续的疗效判断方面具有一定的优势。

2. ctDNA的检测难度

（1）由于ctDNA的不稳定性，样本必须是正确收集和处理
ctDNA是cfDNA的一部分，cfDNA是血液中细胞成分之外的小片段DNA，最早于1948年由Mandel和Metais提出。一旦进入循环系统，cfDNA的清除速度很快，其半衰期为1小时或更短，因此在临床采样后需要尽快分离抽提后进行检验（1-4小时），否则将会大大增加检测的假阴性率。而这样的时间要求在临床实践中极难达到。好在目前临床上进行液体活检时多采用专门的cfDNA采血管，其中含有DNA保护剂和细胞稳定剂，既能够减少cfDNA的降解，还可以避免血细胞破裂所导致的正常DNA稀释ctDNA，可常温下保持cfDNA稳定7-14天，极大地便利了液体活检的临床应用。
（2）难以区分ctDNA与正常cfDNA
ctDNA（通常为小部分）存在于全身正常细胞释放的正常种系cfDNA的背景中。ctDNA擅于伪装，与正常DNA片段差异很小，可以藏匿在众多正常DNA片段中，难以辨别。
（3）血浆中通常含有低水平的ctDNA
据估算，1毫升血浆中含有大约1500个基因组当量（GE，~10 ng DNA）的DNA片段，通常一次10毫升抽血可以从血样中获得4毫升血浆，意味着能够获得6000 GE的DNA片段。在VAF（变异等位基因频率，即变异等位基因在所有等位基因中存在的百分比）为0.1%的情况下，在这6000 GE的DNA片段中，平均只有6个DNA分子携带着想要检测到的基因变异，而且随机取样可能会影响这一数值。因此，可靠、准确且可重复地检测到这些基因变异是一个严峻的挑战。
（4）ctDNA的量与肿瘤负荷有关并且患者之间有所不同
虽然ctDNA的比例趋于平行于个体患者的肿瘤负荷，但在相同癌症类型的患者中仍观察到大量的变异性。即使是在转移性癌症患者中，也有很大一部分患者血浆中ctDNA的比例异常的少。这清楚地表明，除了肿瘤负担以外，还有其它生物因素影响肿瘤DNA的释放。
（5）所使用的技术必须足够敏感以获得低水平变体
ctDNA仅占cfDNA的0.1%~5%，且不同癌种、不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中含量差异较大。因此，需要超敏感方法来检测突变、拷贝数变化或在cfDNA中以非常低的VAF存在的其他变化。

3. ctDNA的检测流程

ctDNA的检测流程大致分为四步：
（1）采血：由于cfDNA自身的不稳定性，通常用专门的cfDNA采血管或EDTA抗凝管进行采血；
（2）离心获得血浆：以足够的离心力将全血（血液经抗凝处理后的全部血液）充分低温离心两次，分离出不含细胞成分的血浆；对于ctDNA分析，血浆样本优于血清（血液不经抗凝处理，自行凝固后，血液除凝固的部分以外的清澈淡黄样本）：血清中cfDNA的总量高出2-24倍，这可能是由于在凝血过程中溶解的免疫细胞释放的DNA的广泛污染，因此，由于野生型DNA的背景水平较低，已证明血浆是ctDNA的优良来源；
（3）从血浆中提取游离DNA：将血浆放置于-80℃冻存直至DNA抽提，或直接进入DNA抽提步骤；由于ctDNA浓度低而且高度碎片化，富集和分离就显得尤为重要；
（4）下游分析：由于正常cfDNA背景中ctDNA的比例很低，因此开发了专门的cfDNA分析方法，包括测序和基于聚合酶链式反应（PCR）分析的方法（BEAMing 和液滴数字PCR等）。

ctDNA的检测流程
资料来源：宽华投研团队整理

4. ctDNA的提取方法

目前常用于分离ctDNA的方法有离心柱法和磁珠法。
离心柱法以硅胶滤膜作为固相载体的，基于二氧化硅选择性结合DNA的独特属性。其原理是带负电的DNA骨架与带正电的硅胶滤膜之间的高亲和力。钠离子起到阳离子桥的作用，它可以吸引核酸磷酸骨架里带负电荷的氧。在高盐条件（pH≦7）下，钠离子可破坏水中的氢与硅中带负电荷的氧之间的氢键。通过大量漂洗去掉所有杂物后，用TE或Tris-Hcl缓冲液或蒸馏水在低离子强度下（pH≧7）洗脱纯化的DNA。
磁珠法带有磁荷的颗粒可通过磁场中的永磁将其移除。这些磁颗粒可用表面包被活性基团的氧化铁颗粒制成，这些活性基团可特异性吸附核酸。因表面积大，结合核酸的能力较强，可作为较好的分离载体。如果赋予容器侧壁磁性，样品混合物中结合有核酸的磁珠则聚集到容器壁，直接倾倒容器可将其他杂质去除，避免了反复离心。磁珠分离技术是现今核酸纯化的一种简单快速的方法。
目前来看，分离和富集血液中的cfDNA并不是瓶颈，市面上有很成熟的试剂盒可以抽提得到足量的cfDNA。瓶颈主要在于之后的ctDNA分析。

游离核酸的常用提取方法比较
资源来源：浙商证券，宽华投研团队整理

责任编辑：Linda
排版编辑：Linda