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在【肿瘤资讯】重磅栏目之“儿童肿瘤年终盘点”上，浙江大学医学院附属儿童医院徐晓军教授详细介绍了微小残留病（MRD）检测的意义，并就NGS-MRD检测在急性髓系白血病（AML）和急性淋巴细胞白血病（ALL）中的应用现状及潜在价值进行深入解读。【肿瘤资讯】特此整理，以飨读者。
医学博士，副研究员、博士生导师，
浙江大学医学院附属儿童医院血液科副主任
小儿血液肿瘤中心副主任
MRD检测的意义
MRD检测作为儿童白血病分层诊疗的重要组成部分，有助于评估患者预后状态，并对患者进行风险分层，指导术后治疗决策。截至目前，MRD检测手段已呈现多样化趋势，其中MFC和聚合酶链式反应（PCR）技术仍为主流应用方法。随着新一代测序技术（NGS）的发展及其在血液肿瘤领域的广泛应用，基于NGS的MRD检测方法（NGS-MRD检测）也日益增多，并逐渐应用于临床实践。
NGS-MRD检测在AML预后评估中的应用及潜在价值
近年来已有众多研究聚焦于使用NGS-MRD检测方法来监测患者治疗前后突变频率的变化，以评估患者的治疗反应及预后。例如，2023年发表的一项研究[1]评估了通过NGS-MRD检测到的治疗后残留体细胞突变是否与后续的治疗结局有显著的相关性。结果显示，部分患者在治疗前呈MRD阳性，而在治疗后检测结果转阴（图1）。值得注意的是，在获得完全缓解（CR）的患者中，转阴的比例显著增高；相对而言，未获得CR的患者，其突变频率往往维持在较高水平（图2）。总体来说，MRD检测结果与患者的缓解状态及长期预后密切相关，对于评估患者的生存率和复发率具有重要意义。
图1. 128例诊断时（A）和治疗后（B）出现体细胞突变的AML患者的突变情况
图2. 生存率情况
同样，Leukemia杂志最新发表的一项研究[2]也进行了类似的探索，该研究发现在首次化疗后第28天，MRD水平为10-2和10-3均与患者的无事件生存期（EFS）和总生存期（OS）存在显著相关性，并均具有预后价值。然而，在第二个疗程后第56天，10-3的截断值（cut off value）在EFS方面并未展现出明显的统计学差异。这表明在治疗过程中，MRD是否能够转阴成为了一个更为关键的预后因素。在完成两个疗程的治疗后MRD转阴的患者，EFS率高达81%；相比之下MRD仍为阳性的患者，EFS率仅为46%（图3）。这一数据表明，MRD转阴与否在预后评估上的差别显著，甚至超过了单纯使用10-3截断值的评估效果。总体而言，尽管NGS技术检测范围广泛但在检测深度上存在一定限制，因此其阴性与阳性的截断值设定在10-4。
图3. 按MRD水平分层的患者治疗结果
竺晓凡教授团队近期在CLINICAL CANCER RESEARCH杂志上发表了一项具有重要意义的研究成果[3]。该研究纳入了50例初诊AML患儿，所有患儿在初诊及后续3个周期的化疗开始前（C2D1，C3D1及C4D1）共4个时间点，同时进行了骨髓MFC、骨髓肿瘤基因NGS及外周血ctDNA检测。结果表明，外周血ctDNA检测与NGS方法检测的骨髓肿瘤基因种类及突变频率的一致率高达92.8%，ctDNA突变丰度与MFC方法检测的MRD水平也具有显著相关性。随后，该研究对外周血ctDNA的预后价值进行了评估。经过3个周期的化疗，外周血ctDNA突变丰度清零的患儿的OS及无进展生存（PFS）率显著高于ctDNA阳性的患儿。这一发现进一步凸显了ctDNA检测在AML中的重要性。这种检测技术有望为临床提供更为便捷和准确的监测手段，使部分患者能够避免繁琐的骨髓检测过程，从而减轻其负担。总体而言，这项研究对于优化AML的治疗方案和预后评估具有深远的意义。
对于儿童ALL MRD监测，NGS-MRD检测比MFC更有意义
NGS-MRD和MFC在预后评估方面均具有重要意义，但当出现检测结果不一致的情况时，例如部分患者的NGS-MRD检测结果为阴性，而MFC结果却为阳性，这部分患者的预后与NGS-MRD和MFC均为阴性的患者相比存在显著差距，表明NGS-MRD检测可以作为MFC的重要补充，有助于筛选出更高危的患者。
近日在Blood杂志上发表的一项回顾性研究[4]对诱导治疗阶段中使用的NGS检测与常用的qPCR方法进行了比较。该研究共涉及432例患者，进行了780次检测，研究结果显示在总体检测水平上这两种方法的一致率达到了81.9%。在780个标志物中，有37个（4.7%）仅通过NGS检测到；有104个（13.3%）仅通过qPCR检测呈阳性，其中很大一部分（23/104；22.1%）通过NGS检测也呈阳性，但是，由于在非相关样本中存在相同的IG/TR重排，这些标志物被归类为非特异性/假阳性。在风险分层方面，诱导治疗结束后，根据qPCR结果有19%的患者被划分为中高危组，但基于NGS-MRD的结果，被重新划分为低危组。这是因为qPCR的结果也可能出现假阳性，导致风险分层评估的误判。尽管存在这些差异，但在诱导治疗结束后，两种方法的一致率仍达到了76%。
图4. 基于患者MRD的风险分层和MRD标记的定量比较
用NGS-MRD检测评估ALL患者造血干细胞移植（HCT）以及CAR-T细胞治疗后的复发风险
既往一项研究结果表明[5]，移植前与MRD阴性的患者相比，MRD阳性患者的复发风险提高了3.56倍。移植后若患者的MRD仍为阳性，复发风险则提高了6.31倍。这些发现均强调了NGS-MRD检测结果的彻底转阴对于降低复发风险的重要性。在多因素分析中，移植后持续MRD阴性被确定为最相关的预后因素。
值得注意的是，该研究还深入分析了移植后可检测的非IgH克隆型对B-ALL的影响。结果发现，在HCT后检测到的29例仅为IgH MRD克隆型的患者中，20例（61%）复发，只有6例（21%）存活。然而，在24例HCT后仅为非IgH(Igκ/λ) MRD克隆型的患者中，只有5例（21%）复发，18例（75%）存活（图5）。
图5. 基于HCT后检测MRD克隆型(IgH与非IgH)的B-ALL患者结局描述
一项发表在Blood Cancer Discovery杂志的研究显示[6]：在CAT-T细胞治疗后28天，MRD的阴性和阳性结果在患者的EFS方面存在显著差异。这说明CAR-T细胞治疗后一个月时，达到MRD阴性对于预后至关重要。换而言之，治疗后若仍为MRD阳性，则意味着这部分病人的复发率可能较高。而在治疗后3个月和6个月时，这种差异则更加显著（图6）。
图6.使用Kaplan-Meier方法绘制了患者达到 MFC-MRD+（蓝线）、10-6水平的NGS-MRD+（绿色）和低于10-6水平但仍可检测到的NGS-MRD+（红色）后到明显复发的累积频率
IGH对MRD监测至关重要，而IGK和IGL的价值相对有限
2023年，本研究团队于Nature Communications杂志发表了一项研究报告[7]，旨在评估IGH和轻链（IGK/IGL）-MRD检测对儿童B-ALL的预后价值。研究结果显示，IGH具有较好的预后意义，但IGK和IGL只能覆盖较小的人群，且其独立预后意义不明显，因此不适合单独评价MRD，且将IGK和IGL水平纳入IGH MRD价值也相对有限。
此外，虽然MFC在诱导治疗结束后也显示出一定的预后意义，但研究发现MFC阴性但NGS-MRD阳性的病人预后较差。双阴性的患者的3年EFS率为97.0%，而MFC阴性但NGS-MRD阳性的患者，3年EFS率仅为84.7%，差距显著（图7）。
图7. MFC和NGS MRD的不一致及其临床意义
进一步分析NGS-MRD检测与预后的关系，可以发现诱导治疗结束后，MRD水平高于10-4的患者预后较差。但只要MRD水平低于10-4，无论其具体值如何，患者的预后都较好。然而，在巩固治疗12周时，若能达到MRD阴性（即低于10-6），患者的3年EFS率可达96.4%（图8）。对于未能达到MRD阴性的患者，可能需要加强干预，例如使用贝林妥欧单抗等药物。例如，本研究发现在使用贝林妥欧单抗后，94.7%的患者的MRD水平下降，约2/3（67%）的患者能够实现MRD转阴。
图8. NGS-MRD与基线临床/实验室特征和生存期之间的关系
最后，通过与健康人群数据库的对比，发现部分非IgH克隆型患者持续处于完全缓解状态。尽管克隆呈阳性，但在正常人群中，这些克隆的出现频率也相当高。这可能意味着这些克隆并非白血病相关克隆，而是反应性B细胞增殖。值得注意的是，IgH克隆在正常人群中出现的比例较少，因此其阳性结果更具意义。这也解释了为什么某些克隆的检测结果不准确，因为它们可能并不代表白血病克隆，而是正常人群中也存在的反应性B细胞增殖。因此，在解读MRD结果时，我们需要充分考虑这些因素。
[1] Li Y, Ruiz JS, Yang F, et al; NGS-defined measurable residual disease (MRD) after initial chemotherapy as a prognostic biomarker for acute myeloid leukemia; Blood Cancer J. 2023 Dec; 13(1): 59.doi: 10.1038/s41408-023-00833-7.
[2] Zaliova M, Zuna J, Winkowska L, et al; Genomic DNA-based measurable residual disease monitoring in pediatric acute myeloid leukemia: unselected consecutive cohort study;Leukemia. 2024; 38(1): 21–30.doi: 10.1038/s41375-023-02083-9.
[3] Lipeng Liu, Suyu Zong, Aoli Zhang, et al;Early Detection of Molecular Resdual Disease and Risk Stratification for Children with Acute Myeloid Leukemia via Circulating Tumor DNA.Clin Cancer Res. 2024 Jan 3. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-23-2589.
[4] Michael Svaton , Aneta Skotnicova , Leona Reznickova , et al; NGS better discriminates true MRD positivity for the risk stratification of childnood ALL treated on an MRD-based protocol.Blood. 2023 Feb 2;141(5):529-533. doi: 10.1182/blood.2022017003.
[5] Emily C Liang, Simone E Dekker, Jean M G Sabile, et al; Next-generation sequencing-based MRD in adults with ALL undergoing hematopoietic cell transplantation;Blood ADV.:2023;7(14):3395-3402.
[6] Pulsipher MA, Han X, Maude SL, et al; Next-Generation Sequencing of Minimal Residual Disease for Predicting Relapse after Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with Acute Lymphoblastic Leukemia;Blood Cancer Discov(2022)3(1):66-81.
[7] Haipin Chen, Miner Gu, Juan Liang, et al; Minimal residual disease detection by next-generation sequencing of different immunoglobulin gene rearrangements in pediatric B-ALL; Nature Communications | (2023) 14:7468.
排版编辑：樊雅琦
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