目前包括单细胞DNA测序（scDNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）等在内的单细胞多组学技术已被用于揭示恶性肿瘤细胞的异质性、阐明其发病及耐药和复发机制等，能够为恶性肿瘤的诊断、预后评估等提供新的策略。文章结合第65届美国血液学年会上的报道对单细胞测序技术在急性白血病诊断和预后评估方面的应用进行阐述。
急性白血病包括急性髓系白血病（AML）和急性淋巴细胞白血病（ALL）。尽管靶向药物、细胞治疗和异基因造血干细胞移植等治疗手段极大改善了急性白血病患者的预后，但原发耐药和复发仍是导致治疗失败的主要原因。因此阐明原发耐药和复发的机制是降低治疗失败率、进一步改善急性白血病患者预后的关键环节。基因组单细胞DNA测序（scDNA-seq）、转录组单细胞RNA测序（scRNA-seq）和表观遗传组单细胞DNA-Met测序（scDNA-Met-seq）等技术的建立使我们能够从单细胞水平解析恶性肿瘤细胞的生物学特性,认识不同肿瘤细胞间的生物学异质性,揭示肿瘤细胞与免疫细胞间的相互作用，并深入了解肿瘤细胞耐药和复发的潜在机制，提高恶性肿瘤患者的个体化治疗水平，改善其预后。本文结合第65届美国血液学会（ASH）年会报道的单细胞测序技术在急性白血病诊断和预后评估中的应用进行综述。
1、单细胞测序技术概述
单细胞测序技术包括分离制备单个细胞、提取遗传物质、扩增构建文本库及高通量测序等步骤，生物信息分析是单细胞测序的重要环节。单细胞测序技术在肿瘤研究中的应用包括：（1）揭示恶性肿瘤细胞遗传异质性、发现新的治疗靶点（如致癌突变）以及筛查耐药新机制等；（2）揭示肿瘤细胞的转录组特征、发现新肿瘤细胞亚群或融合基因以及研发新的预后预测生物学标志物等；（3）研究同一基因在不同细胞群中的表观遗传变化以及这些变化如何介导形成不同的细胞表型；从表观遗传学角度发现治疗新靶点或新的预后生物学标志物等。
2、单细胞测序技术在急性白血病中的应用进展
2.1 单细胞测序技术揭示AML的新生物学特性
AML患者体内的白血病干细胞（LSC）具有独特的基因表达谱和自我更新能力，是导致AML患者耐药和复发的根源。因此从单细胞水平确定LSC自我更新相关的转录组表达谱不仅可为AML患者提供预后生物学标志，还可研发用于治疗的新靶点。
Sachs等利用AML细胞模型进行研究发现，活化的NRAS介导了LSC的自我更新。利用scRNA-seq从LSC富集的AML亚群中划分出具有不同转录谱的LSC亚群；体内白血病植入试验显示CD36 - CD69 + LSC亚群可导致复发，而具有高度增殖能力的CD36 + CD69 - LSC亚群则不会，结果表明仅CD36 - CD69 + LSC亚群具有自我更新能力，提示自我更新和快速增殖能力互斥是小鼠源LSC的重要特征。Lee等开发出一种称为单细胞相关分析（SCA）的计算方法，利用该法对原代AML细胞scRNA-seq数据的基因谱表达水平进行定量测定和统计分析。结果在每个AML样本中鉴定出了表达小鼠单细胞自我更新基因谱的细胞（0.32%～11.5%；错误发现率<0.25）；人类LSC在单细胞水平上的自我更新及增殖基因表达谱也具有互斥特性。以上结果提示基于SCA的自我更新细胞鉴定使我们能在未来的研究中探寻LSC细胞新的转录特征，寻找更有效的治疗靶点。
Wang等对20例初诊成年AML患者的骨髓单个核细胞进行scRNA-seq，并与空间GeoMx图谱相结合，以确定原始AML细胞与分化AML细胞的生物学特征和空间位置。20例患者包括7例二倍体、5例del5/5q、6例del7/7q和3例双缺失（del5/5q和del7/7q）。结果发现Del7/7q亚组的AML细胞高表达人类白细胞抗原（HLA）基因和CD74，与其炎症表型的富集一致；Del5/5q亚组的AML细胞富集增殖信号途径和热休克蛋白。二倍体患者的AML细胞富集GMP样和单核样表型的细胞亚群，HSC样表型的AML细胞见于del5/5q、del7/7q和双缺失的患者。将LSC状态与表型结合后，结果发现除DC样和单核样AML细胞外，其他LPSC、GMP样和前单核细胞样AML细胞均具有LSC样的转录组特征。空间GeoMx分析显示原始状态的AML细胞靠近骨旁，分化状态的AML细胞则在远离骨的空间富集，提示分化状态与空间分布有关。这项研究揭示初诊AML-LSC异质性的功能状态与不同的分化程度和遗传学特征密切相关。此外，原始细胞可能定位在骨旁区。
2.2 单细胞测序技术在急性白血病预后评估中的研究
2.2.1 急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）
尽管群体细胞DNA测序提高了对B-ALL遗传基础和风险分层的认识，但关于B-ALL的肿瘤异质性、白血病发育状态及细胞起源等与预后的关系仍待阐明。Iacobucci等对89例B-ALL患者的样本进行scRNA-seq，并将其与健康人B细胞的scRNA-seq图谱进行了比较。结果发现：（1）等染色体为非整倍体（包括近单倍体和超二倍体）ALL患者的所有原始细胞中都存在染色体丢失或获得。（2）依据转录组谱可将具有DUX4-r特征的B-ALL分成2组：一组炎症评分较高，干细胞基因表达较高，预后较差；另一组炎症评分较低，pro-B相关基因表达较高。（3）人类普通淋巴祖细胞（CLP）保留了由CEBPA控制的转录程序；体外和体内功能分析证实了CLP在pro-B阶段谱系限制之前具有广泛的髓系分化能力。（4）B-ALL的大多数样本表现出与pro-B细胞相似的基因谱表达特征，这些特征在高倍性样本中最为显著；高pre-B细胞富集见于具有MEF2D-r和TCF3∶∶PBX1特征的患者，其中1例ZNF384-r的B-ALL患者诊断时存在LMPP，复发时仍存在这些LMPP样细胞，但其谱系转变为AML。Iacobucci等的研究通过单细胞转录组揭示了B-ALL细胞的转录组谱和发育状态的变化，为改进现有临床和基因组分类提供了新路径，并为预后预测增添了新的生物学标志物。
2.2.2 基于单细胞测序数据和人工智能揭示儿童AML患者的预后标志物
儿童AML具有高度异质性的特征，不同亚型患者预后差异较大，基于单细胞测序技术或数据库研发预后预测新生物标志物是预警预后的重要路径。
Ohlstrom等应用支持向量机（SVM）学习了4个scRNA-seq数据集，根据典型基因表达、患者占有率评分、与健康骨髓的聚类以及已知拷贝数变异的推断改变（inferCNV）对AML细胞进行鉴定，并探讨其与临床预后的关系。结果发现应用SVM分析确定的ARMH1、CLEC11A、NREP、AZU1、PRAME、IFITM2、CFD、DUSP6、SCN3A、CD163、SOX4、IFI30、HOXA9、CD44、SRGN、UBE2C、CXCL8等17个基因组成的基因集区可以区分AML细胞和非AML细胞，曲线下面积为0.84～0.95。HSC样和单核细胞样AML簇在诱导治疗结束后或复发时以>1.5倍的比例富集，具备上述特征的患者临床复发率至少为50%。差异表达（log 2FC>1，调整后 P<0.05）产生了特征基因集（HSC：20个基因，单核细胞样：56个基因）。
高危HSC亚型与化疗耐药（CD69，log 2FC：1.46，调整后 P＝3.48×10 -50）、血管生成（MDK：log 2FC＝1.04，调整后 P＝9.25×10 -50）和生存率低（BCL3：log2FC＝1.18，调整后 P＝1.00×10 -47）相关的基因表达增加；群体RNA测序显示上述特征的患者总生存率较差，各数据集的风险比为1.31～3.35（Cox回归分析显示 P值4.38×10-2～7.20×10-3）。这项研究表明仅根据基因表达就可以将恶性AML细胞与健康细胞区分开来；同时研究揭示了两种高风险的转录组学特征，其中高危HSC亚型的结果尤其差。
2.2.3 通过单细胞DNA测序技术检测微小残留病（MRD）
可测量的MRD是AML患者治疗后白血病复发的根源。虽然目前多参数流式细胞术（MFC）和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）是AML患者MRD检测的金标准，但这些技术自身存在局限性。因此使用单细胞测序（尤其是scDNA-seq）检测AML的MRD很有必要。
第65届ASH会议报道的一项多中心研究中，Pierola等选取了纳入QUIWI-PETHEMA临床试验的15例患者的24份冻存骨髓样本，其中初诊和获得完全缓解的患者样本分别为4份和20份。结果显示：（1）scDNA-seq和金标准技术检测MRD的一致率为75%（15/20）；（2）MFC与scDNA-seq的符合率为78%（11/14）；3例不一致的AML患者的scDNA-seq检测结果阳性，MRD水平在0.04%～0.09%；提示scDNA-seq可以在MRD检测水平非常低时对MFC进行补充；（3）scDNA-seq与qRT-PCR的一致性为66%（4/6），其中1例患者NPM1持续阳性；（4）4例初诊患者中的2例诊断时检测到MRD克隆，由于VAF<1%，这些克隆在初诊时并未被报道；检测到始终无变化的小克隆（VAF约为1%），提示其为克隆造血；（5）在6例接受连续监测的AML患者中发现了克隆清除以及新克隆的获得。
总之，Pierola等的研究提示scDNA-seq是一种可行的检测AML患者MRD的方法；该方法不仅可解析克隆演化和共同存在的多种突变（包括克隆造血），还能确定导致疾病持续存在和复发的优势克隆；此外，该方法能将突变位点与细胞表面标记结合确定突变所在的细胞亚群。尽管scDNA-seq在MRD检测中的价值还需大样本、多中心、前瞻性临床队列验证，但部分学者已提出依据scDNA-seq检测出的MRD指导AML个体化干预的策略（ 图1 ）。
图1单细胞测序技术检测MRD用于指导急性白血病个体化临床决策的模式图
2.3 单细胞测序技术用于白血病治疗和耐药机制的研究
2.3.1 多组学技术揭示TP53突变阳性AML患者药物治疗耐药和复发的机制
约20%的AML患者伴有TP53突变，可导致化疗耐药和不良预后。尽管正在进行的临床试验（NCT04435691）显示马格罗利单抗（抗CD47mAb）、阿扎胞苷和维奈克拉组成的AVM方案治疗TP53突变的AML的初步结果令人欣喜，但揭示患者对AVM方案耐药和复发的机制至关重要。
Desai等利用scRNA和scTCR测序技术对使用AVM方案治疗的11例TP53突变AML患者的27份样本进行了研究，其中8例获得完全缓解（CR）或血细胞计数未完全恢复的CR（CR/CRi），3例未缓解（NR）。27份样本获取的时间点为AVM治疗前（11例）、AVM后CR（11例）、复发（2例）或原发性耐药（3例）。结果显示初诊时AML细胞亚群呈高度异质性。3例原发耐药患者的AML细胞比例增加，以红系分化为表型特征；2例复发患者的AML细胞也表现为红系分化特征，伴高LSC17积分；这些结果提示红系克隆的选择是AVM方案治疗后原发性和获得性耐药性的机制。
Desai等发现CR/CRi患者来源的AML细胞表现出丰富的炎症反应特征，特别是肿瘤坏死因子α和干扰素γ信号通路，这些通路可上调CD47的表达；与CR/CRi患者不同，NR患者的AML细胞显示出氧化磷酸化通路的富集，并伴髓系细胞吞噬活性增强；TP53阳性AML患者接受AVM治疗后不同反应状态患者AML的不同生物学特征提示除TP53突变以外，还有其他机制参与该类AML细胞耐药的形成。随后发现治疗后处于NR的患者，其初诊时CD8 + T细胞的耗竭积分高于CR/CRi患者；治疗后获得CR/CRi的患者复发时CD8 + T细胞的耗竭积分也显著增高；治疗后处于NR患者的效应性CD8 + T细胞富集细胞毒和T细胞受体（TCR）信号通路，且高表达耗竭相关基因。总之，Desai等的研究提示红系分化和氧化磷酸化可能是TP53突变AML细胞内在的耐药机制；CD8 + T细胞耗竭在AML治疗无效和复发机制方面的作用值得关注。
2.3.2 多组学技术揭示贝林妥欧单抗治疗B-ALL的免疫学机制
双特异性T细胞受体（BiTE）可刺激肿瘤细胞附近的T淋巴细胞，诱导T细胞刺激和肿瘤杀伤，其应用于复发难治B-ALL总有效率高达80%。为了克服耐药及研发新一代BiTE，了解BiTE的作用模式及其与肿瘤微环境（TME）的相互作用十分重要。
Shapiro等利用多组学技术探讨了接受贝林妥欧单抗治疗的ALL患者骨髓白血病细胞和免疫微环境的变化。结果发现：（1）BiTE可诱导特征性的T细胞亚群，包括效应性T细胞（CCL5、GNLY、NKG7）、早期IFN-G活化的T细胞（IRF1、GBP5）、活化的细胞毒T细胞（Xcl1-2、IFN-G）以及增殖T细胞（CD69、CCND2）；BiTE活化的淋巴细胞表现出独有的特征：细胞毒（Xcl1、IFN-G、GNLY）、共刺激和T-B细胞对话（CD40、CD27、TNFRSF18）、免疫募集（CXCL10、CCL4）和抗原提呈（TNFSF14、ITGB2）等通路上调。（2）与疾病活动期患者的骨髓微环境以幼稚淋巴细胞为主相比，使用BiTE获得分子缓解期的患者骨髓淋巴细胞区域以具有活性的T细胞和自然杀伤细胞为主要亚群；（3）治疗后所有患者的CD8 +记忆T细胞均处于增殖状态；疾病活动期患者接受BiTE治疗后调节性T细胞（Treg细胞）群有所增加。
原发难治患者骨髓中含有更多的非经典单核细胞，这与患者不良预后有关；除了巨噬细胞前体群体的出现外，这些非经典单核细胞在治疗后被经典的单核细胞取代。总之，该研究为BiTE与骨髓免疫细胞相互作用提供了详尽图谱，刷新了我们对BiTE作用机制的认知，TME变化动力学为患者治疗选择提供了依据。
3、小结与展望
现今单细胞测序技术越来越多地被用于包括急性白血病在内的恶性血液病的诊断、预后评估以及新生物标志物的研发，以期改善患者的预后。
由于篇幅所限，部分第65届ASH年龄上单细胞测序技术在白血病中应用的相关报告不再一一列举。在急性白血病领域，单细胞测序技术未来必将与人工智能技术相结合，相关研究仍会聚焦如下几个方面：首先，揭示初诊急性白血病患者的细胞异质性，发现新的治疗靶点或预后分层生物标志物，剖析白血病细胞原发耐药机制；其次，阐明白血病复发的机制，发现复发干预或治疗的新靶点以及预测复发患者预后的新生物学标志物；再次，将单细胞测序数据与其他技术（如多参数流式细胞术）相结合，构建治疗后白血病细胞克隆演化的追踪体系，实现白血病复发的早期预警。
总之，单细胞测序技术在急性白血病领域的应用有助于更新我们对此类疾病本质和复发机制的认识，研究成果将推动建立系列治疗新技术和预后预测新技术，最终促进急性白血病个性化诊疗水平的提升。
单细胞测序技术在急性白血病诊断和预后评估中的应用进展DOI： 10.3760/cma.j.cn115356-20240104-00003
苏公网安备32059002004080号
