中枢神经系统（CNS）肿瘤包含多种肿瘤类型及其相关亚型，部分肿瘤具有相当高的死亡率和发病率。传统的CNS肿瘤诊断主要基于组织学特征以及与假定的起源细胞类型的相似性。近些年来，随着下一代病理技术和分子生物学的发展，越来越多的研究发现，肿瘤免疫微环境已成为中枢神经系统肿瘤的一个重要方面，可能影响其恶性程度、预后和对治疗的反应。目前，肿瘤微环境研究所用到的分析方法大多拘泥于单独的免疫组化方法，不能同时识别多个标志物，更难以准确分析肿瘤细胞和间质的异质性与演进规律，对于直接影响疗效的肿瘤微环境缺乏诊断方案。
随着蛋白质组学和多重蛋白原位标记测定技术推向应用，以多重荧光免疫组化（mIHC）技术为代表的下一代病理（NGP）技术能够一次检测多个目标靶点，并通过靶点组合和位置关系的研究，实现更准确、更全面、更高效地评估肿瘤免疫微环境，为肿瘤的诊断和免疫治疗提供了可靠依据。
近年来，在中枢神经系统肿瘤研究领域中，以mIHC技术为代表的新兴技术越来越多的得到应用，其显著优势在于：
可以同时评估多个生物标志物：mIHC可以在同一组织切片上同时检测多个生物标志物，提供更全面的信息；
高灵敏度和特异性，荧光信号可以在低浓度下被检测到，并且具有较低的背景信号，提供高灵敏度和特异性；
空间分析：mIHC可以提供细胞和组织中不同标志物的空间分布信息，有助于了解细胞亚群的相互作用和组织结构；
定量分析：通过数字图像分析，可以对mIHC的结果进行定量分析，提供更准确和客观的数据；
多通道成像：mIHC可以使用多个荧光通道同时检测多个标志物，避免组织自发荧光以及串色的干扰。通过mIHC可以对中枢神经系统肿瘤微环境进行全面的分析。基于此，本文汇总了2023年mIHC在中枢神经系统肿瘤的科研应用。
以下是近些年应用mIHC技术在中枢神经系统肿瘤的术后复发、脑转移等领域的典型案例分享。
mIHC技术探索免疫治疗后复发的预测性生物标
研究背景
胶质母细胞瘤(GBM)患者的预后较差，中位总生存期(OS)约为21个月。到目前为止，还没有可靠的标志物对PD-1阻断治疗GBM的反应。
研究内容
在两个独立的胶质母细胞瘤复发（rGBM）的患者队列中，ERK1/2磷酸化(p-ERK) (MAPK/ERK通路激活的标记物)的免疫组织化学可以预测PD-1阻断后的总生存率。接受PD-1阻断治疗的高p-ERK肿瘤患者表现出更长的生存期。
无论BRAF基因的遗传状态如何，GBM肿瘤中都有高水平的SOX2+细胞表达p-ERK。p-ERK水平低的rGBM中，大多数SOX2+细胞不表达p-ERK（图1）。在抗PD-1治疗背景下经历较长OS的患者始终表现出高水平的p-ERK。
空间距离分析发现，与低p-ERK相比，TMEM119+细胞在高p-ERK肿瘤中更接近SOX2+p-ERK+细胞、CD163+细胞与SOX2+p-ERK+或GFAP+p-ERK+细胞之间的距离更短（图2）。
图1. mIHC显示rGBM中SOX2+细胞和相关髓细胞浸润中p-ERK阳性
图2. 空间距离分析TMEM119+细胞在高p-ERK肿瘤中更接近SOX2+p-ERK+细胞
研究结论
该研究证明，只有一小部分接受PD-1阻断治疗的GBM患者表现出放射学反应和生存获益。p-ERK1/2指示rGBM患者对PD-1阻断的反应，rGBM患者拥有由表达MHC II的髓系/小胶质细胞组成的独特肿瘤免疫微环境。这为GBM提供了一个应用个性化方法的免疫治疗的机会，为一部分患者提供治疗益处，同时避免对其他人进行无效治疗。
mIHC技术揭示胶质瘤复发后肿瘤微环境对免疫治疗的响应
研究背景
迄今为止，缺乏可处理和免疫功能的GBM模型阻碍了对GBM和TME之间关系的研究。人们对利用免疫疗法治疗GBM非常感兴趣，但最近的一项临床试验显示，程序性细胞死亡1 (PD-1)免疫检查点抑制剂治疗复发性胶质母细胞瘤时，只有一小部分患者(8%)表现出客观反应。
研究内容
该研究收集了66例复发后接受PD-1抑制剂(派姆单抗或纳武单抗)治疗的成年GBM患者的回顾性研究。基因组和转录组学分析显示，在无应答者中，与免疫抑制表达特征相关的PTEN突变显著富集，而在应答者中，MAPK通路改变(PTPN11、BRAF)显著富集。运用mIHC技术对17例患者（7例无应答者，10例有应答者）的石蜡样本进行分析，发现PTEN突变的肿瘤（无应答者）CD68+HLA-DR−巨噬细胞的密度显著更高。
图3. mIHC显示免疫治疗无应答者和有应答者的肿瘤微环境
研究结论
抗PD-1免疫治疗在GBM中的临床反应与特异性分子改变、免疫表达特征和免疫浸润有关，这些分子改变反映了治疗期间肿瘤的克隆进化。这提示了一种分子的、个性化的方法来优化患者的免疫治疗选择，可能为胶质母细胞瘤的有效治疗提供一种手段。
mIHC技术探索免疫治疗后原发和复发肿瘤微环境的变化
研究背景
脑转移瘤(BrM)是一种常见于肺癌、黑色素瘤和乳腺癌患者的中枢神经系统肿瘤，BrM的出现通常标志着转移性疾病的最晚期，与较差的生存率相关。与复发性胶质母细胞瘤(rGBM)的反应相比，BrM对免疫检查点阻断(ICB)的颅内反应研究较少。
研究内容
该研究对19个ICB-naive和9个ICB-treated BrM样本进行了scRNA-Seq研究，与rGBM相比，ICB引起BrM肿瘤实质明显的T细胞浸润，这与CD206+巨噬细胞从血管周围间隙向肿瘤床迁移有关。利用mIHC和空间转录组学发现，ICB减少了血管周围空间的CD206+巨噬细胞群形成的“血管周围袖口”，这可能是调节T细胞进入BrM。此外，还确定了一个与BrM患者更长的总生存期相关的祖耗尽T细胞亚群（CD8-Tprog.ex，高表达CD28、CD226）。
图4. 接受ICB治疗前后BrM的血管周围T细胞和巨噬细胞的变化
研究结论
研究结果揭示了ICB在原发性和转移性脑肿瘤中的独特和共同作用，这可能为改善脑肿瘤患者的临床结果提供新的治疗策略。rGBM患者可能需要增加TILs的数量，ICB才能诱导有效的抗肿瘤免疫。此外，大量的免疫抑制巨噬细胞/小胶质细胞群体可能是转移性和原发性脑肿瘤的主要障碍。改变这些群体可能会提高两种类型脑肿瘤的免疫治疗效果。
mIHC技术探索免疫治疗后原发和转移肿瘤微环境的变化
研究背景
脑恶性肿瘤包括一系列原发和转移性癌症，包括低级别和高级别胶质瘤以及起源于各种颅外肿瘤的脑转移瘤(BrMs)。我们对脑肿瘤微环境(TME)的了解仍然有限，尚不清楚原发性和转移性脑肿瘤微环境是否有差异。
研究内容
该研究通过多组学技术（流式细胞术、RNA测序、蛋白质微阵列、空间组织表征等）的研究全面分析了脑TME景观。这揭示了疾病特异性免疫细胞的富集，在组织驻留小胶质细胞（MG）、浸润性单核细胞源性巨噬细胞（MDM）、中性粒细胞和T细胞的比例丰度上存在显著差异；IDH突变状态与胶质瘤TAM激活变化相关。
图5. 对脑肿瘤微环境景观的研究揭示了免疫细胞的疾病特异性改变
研究结论
鉴于开发针对脑恶性肿瘤的TME靶向治疗的兴趣，这一免疫景观的综合资源为克服肿瘤支持TME特性并利用TME来对抗癌症的可能策略提供了见解。
单细胞转录组学联合mIHC分析脑转移的肿瘤微环境差异
研究背景
脑转移是最常见的颅内恶性肿瘤，死亡率高，肺癌是脑转移最常见的来源，其原发肿瘤和转移灶中的肿瘤微环境差异还不是很清楚。
研究内容
通过肺腺癌的原发肿瘤和脑转移的scRNA、免疫组织化学和免疫荧光揭示原发和转移肿瘤之间巨噬细胞和T细胞的差异，结果显示脑转移上皮细胞（BMAECs，表面生物标志物S100A9）与转移和预后有很强的相关性，结合医院已有样本进一步评估了脑转移指数的临床意义，确定了包括拉帕替尼在内的7种药物通过靶向BMAEC可能抑制LUAD脑转移。
研究结论
本研究分析了scRNA-seq数据，以表征易转移的LUAD病变的免疫微环境。还发现了一个细胞亚群BMAECs及其潜在的生物标志物S100A9，本研究为脑转移高危患者的早期发现和指导潜在治疗提供了见解，并预测了可能对高转移倾向患者有效的治疗药物，为今后进一步开展相关临床研究奠定了基础。
结尾
作为全球首批推动下一代病理技术（NGP）产业化落地的企业之一，阔然生物于2019年便在国内开展多重荧光免疫组化技术的临床转化研究，并率先打通了多重荧光免疫组化技术上中下游产业链，整合Kreep多色荧光染色试剂盒、Krast全自动染色机、KR-HT5高通量荧光病理切片扫描仪、KRIAS医学病理影像分析系统，形成了针对肿瘤微环境全方位分析的整体解决方案，促进NGP产业化落地。
围绕中枢神经系统肿瘤可以利用前期单细胞转录组、空间转录组等多组学技术结合多重荧光免疫组化技术在定量、原位等方面的优势进一步深入探索肿瘤微环境中细胞的异质性以及变化，以期为更精准的诊断、预后评估、治疗提供新方向。
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