过继细胞疗法（ACTs）出现至今已有几十年时间，CAR-T细胞的成功更是革新了ACTs治疗领域，但同时也清楚的显现出其局限性。未来的肿瘤治疗如要更好的发挥ACTs作用，就要对其存在的问题有着深刻的认识和分析，并积极探索解决方法。近期，中国科学院深圳先进技术研究院学者发表于《血液学与肿瘤学杂志》（Journal of Hematology & Oncology）的一项综述，详细描述了ACT领域药物的发展、优势和可能面临的挑战以及解决方法，并概述了基因转染策略在免疫细胞工程中的重要性以及存在的问题和解决方法。【肿瘤资讯】整理如下，以下读者。
往期回顾：
（一）TIL与TCR ‐ T篇：过继细胞疗法——新技术与新挑战
（二）CAR-T篇：过继细胞疗法——新技术与新挑战
（三）新型细胞疗法篇：过继细胞疗法——新技术与新挑战
ACTs需要将CAR或TCR基因导入受体细胞，并精确控制其表达。理想的基因转染策略应该安全，免疫原性低，能够携带尽可能大的基因片段，允许转染基因保持稳定或在受体细胞中长期表达。目前ACTs经常使用的基因转染策略分为三类： (1)病毒载体，包括逆转录病毒、慢病毒和腺病毒载体；(2)非病毒载体，如转座子、mRNA转染和DNA转染；(3)基因编辑工具，如CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN（图8）。虽然这些基因转染策略显著增加了工程化免疫细胞的能力，但也受到插入突变、转染效率低和成本高等问题的限制。
图8 目前ACTs所用的基因转染策略汇总
病毒载体
γ逆转录病毒
γ-逆转录病毒是首个获批用于临床研究和CAR-T细胞制造的病毒载体，它可运输大量遗传物质，转染各种细胞类型，将外源基因整合至宿主基因组中，确保其持续表达，临床转化迅速，Yescarta和Tecartus采用的就是γ-逆转录病毒载体。但γ-逆转录病毒的整合位点通常靠近启动子，导致附近基因活性改变，可能将健康细胞转化为癌细胞，不过其发生频度较低，无需过度关注，而且成熟T细胞可以通过凋亡和表观遗传机制抵抗致瘤转化，此外未发现载体诱导细胞永生的证据。如有必要，在CAR中添加自杀元件可消除γ-逆转录病毒整合引起的潜在转化风险。然而，γ-逆转录病毒的缺点，如不能感染非分裂细胞以及对宿主转录组产生较大影响，这些使得临床研究逐渐转为以慢病毒载体为主。
慢病毒载体
慢病毒载体能够有效转染静止T细胞，目前已迭代至第三代，通过引入自毁转化、减少同源序列、删除非必需基因、在不同质粒中分散病毒基因等方法，进一步增加其安全性。为提高靶基因表达，在3'LTR中引入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，与cPPT联合可使靶基因表达增加4倍。
与γ-逆转录病毒载体相比，慢病毒载体应用范围更广，转染效率更高，基因负载更大，免疫原性更低。但慢病毒载体也有其局限性，如慢病毒载体整合位点仍为随机，插入突变风险不可避免；多质粒共转化系统使得慢病毒获取困难而昂贵，且易产生批次间质量不一致；慢病毒对某些细胞的转染效率很低，如NK细胞。
其他病毒
除了逆转录病毒家族，腺相关病毒、腺病毒和单纯疱疹病毒也用于基因转染。腺相关病毒既可以转染分裂细胞，也可以转染非分裂细胞，通常不具有致病性或细胞毒作用，因其基因整合率较低，插入突变风险低于逆转录病毒衍生载体，然而其包装容量非常有限(<5kb)。腺病毒包装容量可达8kb，分裂细胞和非分裂细胞均可转染，插入突变风险也较低，但易被宿主固有免疫反应排斥。单纯疱疹病毒是大容量载体(>30kb)，基因转染效率较高，然而免疫原性和靶向性存在局限性，且转染基因在某些器官(如大脑)不能长时间表达。
非病毒载体
转座子
转座子系统基因负载大、转染效率高、使用方便、免疫原性有限、工业成本低，因此在学术和临床研究中应用广泛。两种最流行的转座子系统是睡美人(SB)和piggyBac (PB)。转座子系统也面临一些挑战：靶基因大小对SB转座子的转座效率有显著影响；依赖电子转染的转座子系统可导致大量细胞死亡，且容易整合多个靶基因拷贝；具有插入突变甚至致癌风险。转座子系统是否优于其他基因转染方法，特别是安全性方面，有待进一步研究。
mRNA转染
1.mRNA电穿孔
mRNA电穿孔是mRNA经修饰增加稳定性后，通过电转染，将其引入胞质表达。mRNA在胞质中立即可用，不需进入胞核，提高表达效率同时消除了插入突变可能，因此mRNA电穿孔是最安全有效的基因转染方法之一，而且还具有转染效率高、可以转染几乎任何类型细胞（包括静止或增殖缓慢的细胞以及原代免疫细胞）、易于设计和优化、以较低成本快速生产所需细胞等优点。由于mRNA分子的不稳定性，mRNA电穿孔通常只引起CAR的瞬时表达，通过反复注射可解决，但增加了治疗费用，不过也成为其安全性的保证，因消除了插入突变风险，避免了不可预测后果的发生。重要的是电穿孔通常会造成细胞不可逆损伤，限制了其应用。
2.脂质纳米颗粒介导mRNA转染
脂质纳米颗粒(LNPs)通过内吞作用或膜融合进入细胞并传递mRNA。LNP与电穿孔具有相似的转染效率，且细胞毒作用较低。但LNP介导的mRNA转染的体内稳定性差、生物相容性低、可降解性差、并诱导副作用，因此需要新的策略解决这些问题。
3.外泌体介导mRNA转染
外泌体含有多种功能性分子，可以通过受体介导细胞间的物质传递和交流，其结构稳定，有效保护mRNA免受降解，免疫原性低，能够穿过血脑屏障，易于工程化。因此正在尝试通过外泌体介导基因转染生产CAR-T细胞，但外泌体转染产生的CAR-T细胞对靶细胞的细胞毒作用弱于慢病毒转染产生的CAR-T细胞。目前工程化的外泌体尚未在体内进行检测，但提供了一种新的策略。
DNA转染
DNA较mRNA更稳定，故在ACTs中也尝试将CAR编码DNA传递至免疫细胞。
1.DNA纳米载体电穿孔
CAR编码基因装载至nS/MARt新型DNA纳米载体，电穿孔转染进入细胞，介导靶基因长期稳定表达。基因转染效率与慢病毒载体相似，但CAR表达水平更高，产生的CAR-T细胞在体内具有更强的浸润能力和肿瘤特异性裂解能力，无基因组整合和插入突变风险。研究人员设计了一种生产程序，可在5天内提供临床级CAR-T细胞，而传统慢病毒载体需要12~14天。这种纳米载体尚未在临床研究中进行检测。
2.纳米材料介导靶向DNA分布
直接体内制造CAR-T免疫细胞的方法，避免了体外生产费时费力且昂贵的问题。Stephan等利用携带DNA的纳米颗粒在体内直接对宿主T细胞进行白血病特异性CAR基因编程，产生的CAR-T细胞可迅速消灭癌细胞，减轻肿瘤负荷。最近FDA批准的Onpattro就是将治疗性siRNA封装至LNP。纳米材料在CAR-T细胞制备或作为转座子和基因编辑系统的组成，具有巨大潜力。
基因编辑工具
CRISPR/Cas9
慢病毒和逆转录病毒载体是基因转染的两种主要工具，均存在随机整合问题，影响工程化细胞的质量和疗效。CRISPR/Cas9技术能够实现精确基因编辑，减少随机插入可能，而且设计简单、速度快、成本低、可扩展性好。现已证明CRISPR/Cas9系统在CAR-T细胞和TCR-T细胞治疗应用中具有巨大潜力，但如何获得足够的编辑细胞、潜在的脱靶效应、随机插入/删除突变、产生多个不同敲除表型组合细胞群等问题也带来了新的问题。
TALEN
TALENs和ZFNs也可精确编辑基因，主要用于敲除T细胞的TCR、MHC或CD52基因，制造通用型CAR-T细胞。TALEN是一种人工修饰的限制性内切酶，编辑效率与CRISPR/Cas9相当，甚至更优，尤其是一些难以编辑的基因区域，TALEN可能是更好的选择。
ZFN
ZFN是锌脂蛋白融合蛋白，能特异性识别并结合DNA和FokI核酸内切酶结构域。ZFN已成功用于同种异体CAR-T细胞的制备。尽管TALEN和ZFN具有介导基因插入的能力，但同样存在需要解决的缺点，最突出的是效率相对较低、与CRISPR/Cas9相比更昂贵、难于处理、耗时长，特别是大规模制备免疫细胞时。
基因转染对工程细胞的数量和质量有着重要的影响，好的基因转染方法应该高效、安全、使用简单、价格实惠，但目前尚无技术同时具有所有特点。随着免疫细胞疗法的发展，迫切需要优化现有技术以促进免疫细胞疗法的更迅速发展。
Zhang P, Zhang G, Wan X. Challenges and new technologies in adoptive cell therapy. J Hematol Oncol. 2023;16(1):97. doi:10.1186/s13045-023-01492-8
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