中国人民解放军总医院 肿瘤内科
中国研究型医院学会肿瘤专业委员会青年委员
北京乳腺病防治学会内科专业委员会青年委员
任Technology in Cancer Research & Treatment 、Cancer Pathogenesis and Therapy、Current Drug Targets 编委/审稿人
主要从事胸部肿瘤的内科综合治疗和临床转化研究，至今已发表学术论文27篇，其中中文核心16篇，SCI论文11篇，累计影响因子50+，包括：npj precision oncology、Lung Caner、BMC Cancer、Ther Adv Med Oncol、Technol Cancer Res T、Bmc Pulm Med等杂志。相关研究多次在ASCO、ESMO、CSCO、KSMO（韩国临床肿瘤学会年会）、全国胃癌学术会议（CGCC）、中国肿瘤学大会（CCO）进行壁报展示和交流。
德不近佛者无以为医，才不近仙者无以为医，古时的人们就对于医者的殷殷寄托仿佛告诉我们，只有接近神佛的人才可以悬壶济世。随着时代的进步和社会的发展，临床医师，面对五湖四海的患者，在纷繁复杂的外表下需要我们尽可能地抽丝剥茧发现疾病的本质，从而为患者解除病痛。同时我们对于患者和疾病所思、所感、所悟也会进一步促进我们对于疾病的认识和对于未知的探索。而以科研为体，临床为用的模式下，临床与科研相互融合的模式极大地推动了现代医学的发展。国学大师王国维先生曾经对治学提出了三个境界。在我看来，治学三境界无论是治病救人的专业技能，还是以科研为体的治学，均适用和受用。
治学境界一：昨日西风凋碧树，独上高楼，望尽天涯路。告诉我们对于做学问成大事的人，首先要有有执着的追求，登高望远，瞰察路径，明确目标与方向，了解事物的概貌。学者要有远大理想与坚定的信念，无论在学术研究的道路上有多少坎坷，都要有勇往直前的勇气。
治学境界二：衣带渐宽终不悔，为伊消得人憔悴。喻成大事业、大学问者，不是轻而易举，随便可得的，必须坚定不移，经过一番辛勤劳动，废寝忘食，孜孜以求，直至人瘦带宽也不后悔。这告诉我们要有吃苦耐劳的精神，不忘初心而方得始终。
治学境界三：众里寻他千百度，蓦然回首，那人却在，灯火阑珊处。做学问、成大事业者，要达到第三境界，必须有专注的精神，反复追寻、研究，下足功夫，自然会豁然贯通，有所发现，有所发明，就能够从必然王国进入自由王国。实际就是量变引发质变，上下求索千百次，只要花费的功夫到了，研究成就自然出来了。要求我们在研究过程中不能被世俗繁华迷乱双眼，要发前人所未发之秘。
在求学和临床工作之余，科研也占据了我很大一部分时间。我相信引而申之，定会让临床技能与科研水平相得益彰。而我所研究的方向是计算机辅助设计下的一类全新从头设计靶向CTLA-4超高亲和力小蛋白及其体外抗肿瘤活性机制的研究。
该研究是通过计算机辅助和超级计算机模拟计算的方法设计和筛选高亲和力蛋白。通过蛋白质从头设计的方法，借助已有的蛋白质数据库，根据之前已有的蛋白设计经验通过计算机辅助分子模拟对蛋白结构进行合理搭建,并通过力学优化获得其稳定的三维构象。利用已解析的晶体结构，通过分子对接获得片段与相互作用的复合物模型,经计算机图形学技术、计算生物学相关理论,预测蛋白之间的相互识别区域、关键氨基酸残基及作用模式，同时依据相互作用自由能、分子间氢键、疏水作用等，设计高亲和力的蛋白序列库并对其亲和力进行理论预测。根据突变体序列设计相应的基因序列库并利用真核和原核系统进行表达。下面我就将我所研究的内容陈述如下：
1.研究背景
（1）肿瘤免疫治疗
肿瘤免疫治疗（tumor immunotherapy）主要包括肿瘤疫苗、免疫调节剂、过继性细胞免疫治疗、免疫检查点阻断治疗等四大类，是肿瘤治疗中取得的最重要的进步之一。近年来，随着对T细胞活化、抑制及免疫稳态分子机制等的进一步认识，肿瘤免疫靶向治疗获得了巨大进展。其中，针对细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4, CTLA-4) 和程序性死亡受体 1 (programmed death 1, PD-1) 信号通路的特异性免疫检查点单克隆抗体在肿瘤的临床应用中取得了明显疗效。
肿瘤与免疫系统的相互作用中，肿瘤免疫编辑（cancer immunoediting）是免疫系统限制或促进肿瘤发展的过程，该过程通过三个阶段进行：免疫清除（elimination）、免疫平衡(equilibrium)和免疫逃逸(escape)，而T 细胞主要在免疫清除发挥抗肿瘤效应。
初始 T 细胞的激活是个复杂的过程，有赖于双信号和细胞因子的作用。在抗肿瘤过程中，T 细胞受体(TCR/CD3) 与提呈肿瘤抗原肽的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC) 特异性结合，形成TCR抗原肽-MHC复合物，即产生T细胞对抗原识别的第一刺激信号。表达于抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)表面的配体如B7-1(CD80)或B7-2(CD86)，与T细胞表面的共刺激受体(如CD28)结合，产生T细胞活化的第二刺激信号。此后T细胞内经历信号转导，出现基因转录激活、分泌细胞因子、形成免疫记忆等和激活有关的事件。根据产生的效应不同，可将T细胞表面的共刺激受体分为共激活受体 (如CD28、ICOS) 和共抑制受体(如CTLA-4、PD-1)。因此，第二刺激信号决定 T 细胞是被抗原激活，还是被抑制转为无反应细胞或凋亡。抗肿瘤免疫是由免疫共激活和免疫共抑制通路在肿瘤微环境中达到平衡控制的，因而可通过阻断抑制性通路来调节细胞毒性T细胞和增强抗肿瘤免疫，引发持久的抗肿瘤效应。
（2）CTLA-4
CTLA-4，又称CD152，表达于活化的CD4+ 和CD8+ T细胞。CTLA-4与CD28同源，均为免疫球蛋白超家族成员，配体均为主要表达于淋巴结和脾脏APC 表面的B7分子。CD28结构性地表达在 T 细胞表面，而CTLA-4表达于活化的T细胞表面，并于T细胞活化的起始阶段发挥负性调控作用。CTLA-4以高于CD28分子10-20倍的亲和力与配体B7-1(CD80)或B7-2 (CD86)分子结合。CTLA-4分子的胞质区有免疫受体酪氨酸抑制基序 (immunoreceptor tyrosine-based i nhibition motif, ITIM)，CTLA-4与配体结合后，ITIM中的酪氨酸残基被磷酸化，可募集蛋白质酪氨酸磷酸酶 SHP-1和SHIP并与之结合，这些磷酸酶通过对T细胞活化途径中重要信号分子的去磷酸化，从而抑制T细胞活化信号的转导。
因此，CTLA-4与B7竞争性的结合能够阻止CD28与B7结合产生的共激活信号通路，并决定T细胞是否被激活或被抑制。CTLA-4分子在T细胞的分布受T细胞激活信号的调节。在初始T细胞，CTLA-4位于胞质内，当CD28与B7结合产生刺激性信号后，CTLA-4通过胞外分泌方式高表达于T细胞表面。由此可见TCR信号通路的激活能正反馈于CTLA-4，使其向细胞表面迁移，此后细胞表面的CTLA-4与B7分子结合，抑制IL-2的分泌及细胞周期，T细胞的激活通路即被阻断。CTLA-4在免疫系统的其他方面也发挥重要作用：调节性T细胞 (regulatory T cell, Treg) 结构性地表达CTLA-4，能够抑制效应T细胞的功能，调节外周免疫耐受。Treg可通过CTLA-4下调APC表面CD80/CD86蛋白水平，从而抑制CD28共刺激信号通路。
（3）临床应用
CTLA-4和 PD-1 信号通路阻断剂在实体肿瘤治疗的临床前试验取得了很好的疗效，抗CTLA-4、PD-1、PD-L1的单克隆抗体陆续被美国食品药品监督管理局 (FDA) 和中国国家药品监督管理局（CNPA）批准应用于黑色素瘤、恶性胸膜间皮瘤等多种实体瘤的临床治疗。目前已经获批临床上市的CTLA-4药物只有百时美施贵宝（Bristol-Myers Squibb，BMS）公司研发的 Ipilimumab（伊匹木单抗，商品名：Yervoy®，逸沃®），Ipilimumab 是一种抗CTLA-4的全人源单克隆抗体，是第一个用于肿瘤治疗的免疫检查点药物，也是第一个被证实可以延长晚期黑色素瘤患者总生存期 (overall survival, OS) 的药物。目前其他在研的CTLA-4抑制剂，诸如Tremelimumab、AGEN1884 AK104等药物的相关临床研究也在积极开展中。
与明星靶点PD-1/PD-L1药物上市“百花齐放”不同，CTLA-4抑制剂研究起步早，但临床应用较晚。现有CTLA-4抑制剂在单药使用治疗实体瘤时，仍旧存在应答率有限以及耐药的常见问题。目前FDA已批准Ipilimumab 与Nivolumab（纳武利尤单抗，商品名：Opdivo®，欧狄沃®）联用用于治疗黑色素瘤、恶性胸膜间皮瘤等，即Opdivo®+Yervoy®（O+Y）的双免疫检查点抑制剂治疗策略。CheckMate-743研究是首个且唯一证明一线免疫治疗能够改善恶性胸膜间皮瘤患者生存获益的Ⅲ期临床研究，结果表明与化疗组相比，O+Y组的中位OS显著延长（18.1个月vs 14.1个月），死亡风险降低26%。CheckMate-227 (NCT02477826)是评估以Nivolumab为基础的治疗方案(或联合Ipilimumab)对比含铂双药化疗用于晚期NSCLC患者一线治疗的情况。2021年6月中位随访时间超过4年（49.4个月）与单独化疗相比无论患者PD-L1表达水平和肿瘤组织学类型如何，Nivolumab联合Ipilimumab一线治疗晚期NSCLC都能够带来持久且长期的生存获益：本研究的主要患者人群（PD-L1 ≥1%）中， O+Y组患者四年生存率达到29%而化疗组18%（HR=0.76；95% CI：0.65-0.90）。针对PD-L1<1%的患者，O+Y组患者的四年生存率是化疗组的2倍以上（分别为24%和10%；HR= 0.64；95% CI：0.51-0.81）。
不同于Checkmate系列研究，MYSTIC研究使得对于肺癌的双免疫治疗策略让我们又有了些犹豫。MYSTIC研究是Ⅲ期入组IV期初治非小细胞肺癌驱动基因阴性的患者，他们随机分配至3个队列，分别接受4-6周期含铂双药化疗，Durvalizumab(度伐利尤单抗，PD-L1免疫检查点抑制剂)单药或其联合Tremelimumab。结果显示客观缓解率（ORR）在化疗、免疫单药及双免疫联合治疗组中分别为37.7%，35.6%及34.4%，化疗组中位缓解持续时间4.4月，免疫组未达到。中位随访时间10.6月，无论是次要终点对比Durvalizumab单药和化疗（4.7月vs 5.4月）和主要终点双免疫联合对比化疗（3.9月vs 5.4月）均未见PFS显著改善。总生存结果类似，同样未看到两种免疫治疗模式分别和化疗相比能显著改善OS（16.3月 vs 12.9月；11.9月 vs 12.9月）。
2.研究目的与意义
基于Checkmate 227、CheckMate-743和MYSTIC研究等研究表明联合阻断CTLA-4与PD-1/PD-L1是目前提高抗肿瘤疗效的策略之一。目前Ipilimumab、Tremelimumab等都能够阻断CTLA-4的结合位点，但MYSTIC研究却意外取得了阴性结果。通过解析Ipilimumab与CTLA-4复合物结构可知，Ipilimumab的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）均参与了结合CTLA-4前β折叠。对于Ipilimumab和Tremelimumab亲和力比较研究显示，二者在相同的结合表位上以不同的结合模式与CTLA-4结合。对CTLA-4/B7-1复合物与Ipilimumab/CTLA-4复合物进行的叠加分析表明，Ipilimumab通过直接占据CTLA-4与B7-1或B7-2结合的位点以行使阻断CTLA-4与B7-1或B7-2结合的功能。相比Tremelimumab而言，Ipilimumab具有较高的解离率，这个特性可能会影响其药物代谢动力学，继而推测二者之所以有较大临床效果的差异可能是由于两类抗体IgG类型的不同形成，显然 CTLA-4 抑制剂在肿瘤的临床应用中还要克服很多障碍。
目前认为，抗体的结合表位（epitope）是影响免疫治疗疗效的重要因素之一，借助单克隆抗体技术阻断CTLA-4免疫抑制信号无法实现对CTLA-4相互接触作用面的完全覆盖。Checkmate-227、CheckMate-743大获成功，而MYSTIC研究却宣告失败，这些数据表明CTLA-4抗体结合表位的细微差别很有可能是其对疗效产生显著影响的原因之一。因此，如何更加有效地阻断CTLA-4的结合，进而更加有效的抑制免疫抑制信号是目前亟待解决的问题。因此，目前迫切需要开发出一种能够更加精准、高效地阻断CTLA-4结合的方法，从而更加有效地抑制CTLA-4免疫抑制信号的药物。在前期的研究中，我们利用Rosetta平台通过计算机辅助的蛋白质从头设计（De Novo design）技术，筛选并合成了具有高亲和力的CTLA-4靶向蛋白。经前期实验验证，该蛋白体外可与CTLA-4有效地竞争性结合。
3.研究内容
利用Rosett软件的blueprint方法，通过计算机辅助和超级计算机模拟计算的方法筛选CTLA-4的高亲和力蛋白。通过蛋白质从头设计的方法，借助已有的蛋白质数据库，根据之前已有的蛋白设计经验通过计算机辅助分子模拟对CTLA-4结构进行合理搭建,并通过力学优化获得其稳定的三维构象。利用已解析的晶体结构，通过分子对接获得片段与相互作用的复合物模型,经计算机图形学技术、计算生物学相关理论,预测蛋白之间的相互识别区域、关键氨基酸残基及作用模式，同时依据相互作用自由能、分子间氢键、疏水作用等,设计高亲和力的蛋白序列库并对其亲和力进行理论预测。根据突变体序列设计相应的基因序列库并利用真核和原核系统进行表达。通过酵母展示技术进行目的蛋白的筛选，然后将亲和力强的基因序列导入原核表达系统,通过ELISA、Western blot、电镜分析、竞争结合实验等手段对表达的蛋白进行相应的检测。
4.研究方法与技术路线
（1）筛选出CTLA-4高亲和力的核酸和蛋白序列
为了筛选出具有高亲和力的CTLA-4核酸和蛋白序列，采取了计算机辅助蛋白质从头设计的方法，预测蛋白质的相互识别区域、关键氨基酸残基及作用模式，获得高亲和力的蛋白序列库。之后采用酵母展示文库技术对候选蛋白进行筛选。首先将合成的候选蛋白基因借助电转法与pETCON载体片段按照2：1的比例，电转至EBY 100酵母细胞。借助双缺陷( Ura/ Trp)培养板30℃培养2天后，确认其电转效率(大于1×105)。电转后的酵母细胞在双缺陷培养基 (30℃，250rpm)培养两天后。按照1：100稀释比例，在富含乳糖的诱导培养基中进行展示蛋白的诱导表达。
采用生物素标记的CTLA-4作为靶蛋白，借助Avidin,NeutrAvidinTM ,PE conjugate(A2660)和anti Myc tag antibody FITC (ab1394)进行双色流式染色。选择靶蛋白浓度在10nmol情况下，探索与CTLA-4蛋白不同浓度50nmol、25 nmol、12.5 nmol、6.25 nmol、1 nmol、500 pmol和250 pmol的结合情况。与靶蛋白CTLA-4在室温孵育15分钟，然后将该蛋白孵育混合物与表达候选蛋白的酵母细胞进行室温孵育15分钟。通过双色流式技术评估候选蛋白的竞争结合活性（相关预实验结果如下图所示）。
（2）具有CTLA-4超高亲和力蛋白的合成
为了根据筛选到的CTLA-4超高亲和力蛋白的基因序列合成对应的蛋白，采取全基因合成和大肠杆菌蛋白表达系统的办法，将载体转入大肠杆菌内表达后破菌纯化得到具有CTLA-4高亲和力的蛋白。
（3）具有CTLA-4超高亲和力小蛋白的表达纯化
将该载体转化大肠杆菌后，在肉膏蛋白胨培养基（LB培养基）37℃，270rpm培养至OD600＝0.6-0.8，然后采用 1mM的IPTG（1:1000）诱导菌液蛋白表达过夜。收菌后，加入Protease Inhibitor Cocktail和Benzonase®核酸酶，借助超声破菌(4分钟，10s on，10s off，80％Amplifaction)后取上清。借助Ni柱纯化后，将浓缩后的样品过分子筛进一步纯化。采用SDS PAGE和考马斯亮蓝染色评估蛋白表与纯化，借助BCA法进一步确定蛋白的浓度。通过该方法获得高纯度的候选蛋白用于后续试验。
（4）靶向CTLA-4高亲和力小蛋白亲和力和结构稳定性检测
借助ForteBio Octet对高亲和力阻断蛋白进行亲和力检测。首先将3μg/ml的生物素标记的人CTLA-4蛋白装载到偶联亲和素的检测探头上(300s)，在PBST溶液中洗脱尚未结合的生物素标记的人CTLA-4蛋白。然后将带有人CTLA-4蛋白的检测探头同时浸没在等两倍比稀释的靶向CTLA-4高亲和力小蛋白溶液中，检测结合信号(300s)。再将探头浸没PBST中，检测结合蛋白的解离信号。最终计算出高亲和力阻断结合蛋白的亲和力。借助JASCO 1500对蛋白结构稳定性进行检测。选择从190nm 260nm波长范围进行检测，首先测定靶蛋白在25℃(0 .1mg/ml)蛋白的圆二色信号，然后将蛋白升温至95℃后检测蛋白的圆二色信号，最后将温度恢复到25℃并静置5分钟后的圆二色信号。获得该蛋白在不同温度下，蛋白二级结构构象的变化，进而评估结合蛋白的结构稳定性。
（5）在细胞水平上验证CTLA-4高亲和力蛋白的结合水平
为了进一步明确CTLA-4高亲和力蛋白在细胞学水平上与CTLA-4结合的能力，拟使用MC38小鼠结直肠癌细胞系和4T1小鼠乳腺癌细胞进行验证。
5.与本课题有关的国内外研究进展及存在问题
（1）国内外研究进展
蛋白质的一级结构决定其高级结构，而蛋白质从头设计（De Novo design）最早出现在20世纪80年代左右，意图探索巨大的序列空间和结构空间。随着CASP14中alphafold2的横空出世，蛋白质折叠的问题可以说已经基本解决，深度学习已经彻底地改变了蛋白质结构预测领域。虽然目前它对蛋白质设计领域的影响还较小，但与结构预测互补的蛋白质设计问题也必将释放潜力迎来巨大发展。随后蛋白质设计的革命的出现，导致计算方法的出现与建立。蛋白质计算设计是指建立目标骨架结构并找到与其兼容的蛋白质序列的过程。这种方法最早于20世纪90年代开始出现，当时的研究者认识到亟需更加通用的设计方法来探索巨大的蛋白质序列与结构空间。在蛋白计算设计的早期，通常根据一些蛋白质的三级与四级结构的少量几何参数建立参数模型。
蛋白质计算设计的里程碑事件是Baker的基于片段的设计方法，现已经被广泛使用。该方法首先定义了所需蛋白质的粗粒图，其中包含了二级结构和残基接触的位置等信息。该蓝图定义了目标折叠，并指导寻找满足设计的主干，然后使用满足设计约束的主干片段进行拼接，产生物理上合适的主链，然后根据这个主链进行序列设计。然后对设计的结构序列再次使用骨架片段组装和能量最小化来进行股价搜索并迭代多次，得出收敛的可设计的主干序列。通过Rosetta Remodel等框架实现的蓝图设计在已经成为从头蛋白质计算设计中最成功的方法之一。
随着近20年来计算设计的不断发展，能量函数、主链设计、侧链优化的算法都得到了不同程度的发展，量函数的发展为计算设计更精准地评估结构。同时，定义骨架方法主要发展为蓝图构建、拓扑构建与结构扩展等方法，能够创建理想的蛋白质支架。最后，在侧链优化中，也衍生了FastRelax、HBNet等方法。众多蛋白质设计方法的爆炸性增长极大地增加了可以通过计算解决的挑战的广度。
（2）存在的问题与挑战
①蛋白质计算设计不总是完全稳健和令人满意的，通常需要结合实验方法来获取满意的实验结果。蛋白质计算设计提供了一个潜在的文库，然后通过酵母表面展示等高通量方法选择稳定的序列。可能需要进一步改进设计规则与计算方法才能够提高设计的准确率，减少实验筛选的负担。使用完全从头设计的骨架实现与自然界中观察到的小分子结合与催化是正在进行的一项困难和挑战。通过改进力场，可以更准确地捕获驱动蛋白质-金属、蛋白质-蛋白质和蛋白质-小分子之间的相互作用，将是蛋白质计算设计的关键。
蛋白设计现在仍然普遍聚焦于设计高热稳定性蛋白，但自然界中的蛋白普遍没有如此高的稳定性进化压力，人工设计的高热稳定蛋白可能会存在构象变化、动力学、变构等方面的限制，而这些则是实现蛋白质功能和调控的关键。随着能量函数、骨架设计和侧链优化的不断优化迭代，使用计算设计进行蛋白质从头设计已经进入到了一个前所未有的时代，越来越多的复杂蛋白结构设计与功能设计都将成为可能。尽管已经取得了重大进展，但是使用深度学习方法纳入数据衍生方法可能会改变游戏规则。
②锦上添花还是画蛇添足？KEYNOTE-598研究表明Pembrolizumb联合伊匹木单抗相比帕博利珠单抗单药一线治疗PD-L1 TPS≥50%且无EGFR或ALK基因突变的转移性NSCLC患者并不能改善疗效且毒性更大。数据进一步支持了帕博利珠单抗单药仍然是PD-L1高表达转移性NSCLC的标准治疗。这不难让联想到同样是双免疫组合“PD1+CTLA-4”，每种PD1单抗类药物、联合作用和效果是不同的。O+Y 具有独特的互补作用机制，其中O药恢复了肿瘤T细胞功能,Y药诱导新生抗肿瘤T细胞反应，包括记忆性T细胞的增加，弥补了O药在转移性NSCLC一线中的空白。值得思考的是这种明显互补机制是否仅限于O药？CheckMate-227虽然整体显著提高了晚期非小细胞肺癌患者的CR率和生存期，但当我们细分人群，对于PD-L1高表达的患者在一线选择上真的是联合越多效果越好吗, CTLA-4抑制剂的加入到底是锦上添花还是画蛇添足？后续还需要进一步从基础作用机制和临床治疗实际进行充分的验证。
6.课题的原创性及创新点
(1)与常规CTLA-4免疫检查点抑制剂相比，计算机辅助设计的蛋白具有分子量小、较高的组织穿透能力，本身具有很高的亲和力，可达皮摩尔（pmol）水平。该方法克服了传统工艺制备抗体步骤繁杂、耗时久、成本高等难题。
（2）该蛋白可能是目前分子量最小且亲和力最高的靶向CTLA-4的蛋白，为肿瘤疾病的药物开发和靶点选择提供候选。
（3）通过此项目，验证计算机辅助的蛋白质从头设计技术这一新技术在人工设计和合成蛋白质领域的可行性和合理性。
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