天津医科大学肿瘤医院 肝胆肿瘤科
天津市抗癌协会肝胆专委会 秘书
天津市健康教育协会肝胆外科专委会 委员
天津市科技进步二等奖
主要完成人;主持天津市教委科研计划项目1项、天津市卫健委课题1项
以第一作者及共同第一作者身份发表SCI论文5篇，累计影响因子40.3
肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的发病率和死亡率分别位居所有恶性肿瘤中的第5位和第3位，并且逐年增加[1]。全世界每年报告约75万例新发肝癌病例。原发性肝癌诊疗指南（2022年版）指出，肝癌目前是我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，严重威胁我国人民的生命和健康[2]。手术切除仍是肝癌的主要治疗方法，虽然近年来介入治疗、免疫治疗和靶向治疗取得了一定的突破[3]，但肝癌的治疗现状仍不容乐观，根治性切除术后5年转移率为 60%～70%，五年生存率不足15%[4]。因此，侵袭转移是肝癌诊疗过程中面临的最为复杂的考验，也是目前肝癌研究的热点和难点。
大量研究揭示了自噬与肝癌侵袭转移间的关系。化疗诱导的自噬可能导致肝细胞癌治疗中的侵袭转移以及化疗耐药。在体内外实验中，包裹奥沙利铂和羟氯喹（HCQ，自噬抑制剂）的仿生纳米制剂（TH-NP）可以显著抑制肝癌细胞的转移能力，提高其化疗敏感性[5]。激活自噬可促进肝癌细胞的侵袭转移能力和糖酵解水平，自噬通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌细胞的转移[6]。低氧诱导因子-1α（HIF-1α）在缺氧期间可通过激活YTHDF1增加ATG2A和ATG14的表达水平，诱导自噬的发生，促进肝癌细胞的转移[7]。本人前期研究结果也表明：核糖体调控因子PNO1可通过影响肝癌细胞自噬进程促进其侵袭转移的发生（Cell Death & Disease，2021，共同第一）。
PNO1（partner of NOB1）又被命名为Dim2、Rrp2或Yor145，是核糖体新生调控因子，由PNO1基因编码而成，在核糖体的生物学进程中扮演着至关重要的角色[8]。自2018年起，本人课题组围绕“PNO1、肿瘤微环境及恶性肿瘤侵袭转移”这一研究方向进行一系列探索，拓展了PNO1在恶性肿瘤领域研究的维度。本人在攻读博士期间发现PNO1在肺腺癌的转移中扮演重要角色，一系列体内外实验证实高表达PNO1可促进肺腺癌细胞的侵袭转移（Oncogenesis, 2020，第一作者）。本人通过多种体内外实验证实PNO1可通过MAPK/Erk信号通路介导的自噬促进肝癌细胞的侵袭转移（Cell Death & Disease，2021，共同第一）。但PNO1通过何种关键分子调控MAPK/Erk通路介导的肝癌细胞自噬，其具体机制仍需进一步的分子生物学研究，这也是该研究的重点之一。本人课题组在2022年最新提出PNO1可通过GSH代谢重编程调控肝癌细胞的铁死亡（Cell Death & Disease，2022）。这一系列成果均表明本人及所在课题组对PNO1的功能、PNO1对肿瘤微环境的影响及其在恶性肿瘤侵袭转移中的作用具有较为系统的认识，具备探索潜在机制的能力。因此，本人在前期已发表文章的基础上，将后续研究重点主要聚焦于PNO1介导的肝癌细胞自噬是通过何种途径诱导肝癌细胞侵袭转移这一关键问题上。
本人课题组前期证实PNO1在参与调控肝癌的侵袭转移中发挥着至关重要的作用（研究基础图1）。同时在研究过程中意外发现高表达PNO1的肝癌组织中CD4+ T淋巴细胞及CD8+ T淋巴细胞的浸润较少，进一步应用包含72例肝癌患者临床病理信息的组织芯片，借助免疫组化实验再次明确：在肝癌组织中，PNO1与CD4+ T淋巴细胞及CD8+ T淋巴细胞的表达水平呈负相关，PNO1、CD8+ T淋巴细胞的表达水平和BCLC分期是影响肝癌无复发生存期的独立危险因素（研究基础图2）。基于此，本人初步推测PNO1可能参与调控肝癌的免疫微环境，高表达PNO1促进肝癌细胞的免疫逃逸。
为了进一步证实PNO1与肝癌细胞免疫逃逸间的关系，本人提取GEO数据库肝癌组织中PNO1的表达值，通过GSEA聚类分析及相关性分析再次证实：PNO1参与T淋巴细胞的激活并促进其分化，PNO1与激活肝癌细胞免疫进程的重要分子标记物的表达水平呈负相关（研究基础图3）。本人课题组构建了Hep1-6鼠源稳定PNO1降表达及对照组细胞系，在野生型C57BL/6小鼠中皮下注射两组细胞系，待稳定成瘤后通过流式细胞学检测和免疫荧光实验证实PNO1与肝癌细胞免疫进程密切相关（研究基础图4），基于前期发表文章及研究基础，本人推测免疫逃逸可能是PNO1介导的肝癌细胞自噬与侵袭转移间的重要“桥梁”。Pan课题组于2019年通过体内外一系列实验报道了PNO1在肝癌增殖和侵袭转移中的作用，提出PNO1可以作为肝癌的新靶点被Celecoxib（塞来昔布）靶向抑制[9]。因此，通过塞来昔布逆转高表达PNO1介导的肝癌细胞自噬，阻止肝癌细胞免疫逃逸导致的肝癌侵袭转移，也是本人后续研究的重点之一。
有研究发现MAPK通路中的关键分子可上调非小细胞肺癌中PD-L1的表达水平并促进肿瘤细胞的免疫逃逸[10]。TIM-1Breg细胞通过HMGB1-TLR2/4-MAPK生物学轴抑制肝癌细胞的免疫进程[11]。本人前期发表文章证实PNO1可通过MAPK/Erk通路调控肝癌细胞的自噬进程（Cell Death & Disease，2021，共同第一），寻找PNO1-MAPK/Erk生物学轴中介导肝癌细胞自噬以促进其免疫逃逸的关键分子尤为重要。本人通过TMT（Tandem Mass Tag）标记定量蛋白质组学分析发现NF1（Neurofibromin 1）可能是PNO1与MAPK/Erk信号通路间的“纽带”。NF1（又称WSS, NFNS或VRNF）的突变与I型神经纤维瘤病、幼年骨髓单核细胞白血病和Watson综合征有关[12]。NF1 mRNA可受到RNA编辑（CGA>UGA->Arg1306Term）的影响，导致翻译的过早终止[12]。有研究表明NF1的基因产物可以作为MAPK/Erk信号转导途径的重要调控因子[13]。但NF1与肝癌细胞自噬间的关系报道甚少，本人首先基于TCGA及GEO数据库的大样本分析，初步发现NF1可以促进肝癌细胞的自噬进程且与自噬重要标志物（Beclin-1、LC3B、ATG5和ATG7）的表达水平呈显著正相关。进一步在PNO1过表达肝癌细胞系中抑制NF1表达水平，通过RT-PCR证实PNO1可通过调控NF1表达水平影响肝癌细胞的自噬进程（研究基础图5）。
本人继续通过动物实验探索PNO1介导的肝癌细胞自噬与免疫逃逸间的关系，将Hep1-6 PNO1稳定降表达细胞系及对照组细胞系注射入野生型C57BL/6小鼠中，待稳定成瘤后在对照组细胞系中加入自噬抑制剂CQ（Chloroquine，氯喹），通过流式细胞学检测发现加入CQ组与降表达PNO1组的CD8+ T细胞及MHC-I细胞数量均增高，因此本人初步推测PNO1介导的肝癌细胞自噬可能通过减少MHC-I对CD8+ T淋巴细胞的抗原呈递以促进肝癌细胞的免疫逃逸（研究基础图6）。肿瘤细胞可以通过下调其表面MHC复合体的表达来逃避T细胞的杀伤，由于肿瘤抗原呈递主要通过MHC-I类途径，该途径的缺陷比MHC-II类抗原呈递的缺陷更易被观察到[14]。因此，MHC-I与CD8+ T细胞的抗原呈递途径对抑制肿瘤细胞的免疫逃逸至关重要[15]。本人进一步通过免疫印迹实验证实了上述推测，发现加入CQ组与降表达PNO1组的ATG5、ATG7、Beclin-1的表达水平较对照组均降低，反之，MHC-I表达水平则升高（研究基础图6）。国内外学者亦阐明了自噬蛋白及MHC-I间的相互作用对肿瘤免疫逃逸的影响，自噬蛋白MAP1LC3可与NLRC5相互结合，抑制NLRC5介导的MHC-I抗原呈递途径导致子宫内膜癌的免疫逃逸[16]。在胰腺癌中MHC-I通过自噬依赖的机制被运往溶酶体中降解，使胰腺癌中用于抗原呈递的MHC-I减少，从而导致了胰腺癌的免疫逃逸[17]。
基于前期研究基础结合相关的文献报道，本人提出以下假设：高表达PNO1通过激活NF1介导的肝癌细胞自噬，促进自噬溶酶体对附着在肿瘤细胞的MHC-I复合体的降解，减少MHC-I复合体对CD8+ T淋巴细胞的抗原呈递，诱导肿瘤细胞的免疫逃逸进而促进肝癌的侵袭转移。
本项目将在课题组前期研究发现的基础上，深入探讨PNO1上调NF1诱导肝癌自噬促进肝癌侵袭转移的机理，明确PNO1通过促进肝癌细胞自噬介导肿瘤免疫逃逸的分子机制，利用不同模型探讨PNO1抑制剂塞来昔布用于治疗高转移潜能肝细胞癌的治疗效果，有望为开发靶向肿瘤微环境新的治疗方法提供理论依据。
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PNO1高表达提示恶性肿瘤的不良预后
本人前期通过对TCGA公共数据库泛癌种数据的探索挖掘，发现PNO1在肝癌及肺腺癌等多种恶性肿瘤中高表达（研究基础图1.A）。随后应用免疫组化对肺腺癌及肝癌患者进行PNO1染色评分验证了这一结论，应用PNO1表达水平的平均值作为临界值，将患者分为PNO1高表达组及PNO1低表组，分析PNO1与肺腺癌及肝癌患者预后间的关系，结果表明：PNO1高表达是影响肺腺癌患者总生存期的危险因素，PNO1高表达是影响肝癌患者无复发生存期的危险因素（研究基础图1.B-E）。
研究基础图1. PNO1高表达提示恶性肿瘤的不良预后 A. TCGA数据库显示PNO1在肺腺癌及肝癌等多种恶性肿瘤中高表达；B-E. 免疫组化法分析发现PNO1高表达是影响肺腺癌患者总生存期的危险因素，PNO1高表达影响肝癌患者无复发生存期的危险因素 （Oncogenesis. 2020. 9(5): 58， Cell Death Dis. 2021. 12(6): 552）。
PNO1与CD8+ T淋巴细胞表达水平负相关，两者均为影响肝癌无复发生存期的独立危险因素
本人在研究过程中发现PNO1高表达肝癌组织中CD4+及CD8+ T淋巴细胞浸润较少（研究基础图2.A），遂进一步应用肝癌组织芯片进行验证，结合免疫组化染色和Pearson法发现PNO1的表达水平与CD4+ T淋巴细胞表达水平呈负相关（研究基础图2.B），其与CD8+ T淋巴细胞表达水平呈显著负相关（研究基础图2.C）；随后本人分析影响72例肝癌患者无复发生存期的独立危险因素，结果表明：PNO1、CD8+ T淋巴细胞的表达水平及BCLC分期是影响肝癌无复发生存期的独立危险因素（研究基础图2.D-G）。
研究基础图2. PNO1与CD8+ T淋巴细胞表达水平负相关，两者均为影响肝癌无复发生存期的独立危险因素 A. PNO1、CD4+ T淋巴细胞及CD8+ T淋巴细胞在肝癌中的免疫组化染色；B&C. Pearson法分析PNO1与CD4+ T淋巴细胞及CD8+ T淋巴细胞表达水平间的相关性；D-G. PNO1、CD8+ T淋巴细胞表达水平及BCLC分期是影响肝癌无复发生存期独立危险因素（本人未发表数据）。
公共数据库证实PNO1参与调控肝癌细胞免疫进程
本人对HCC生物信息学数据库进行了探索挖掘，提取GEO数据库肝癌组织中PNO1的表达值，通过GSEA聚类分析证实高表达PNO1可抑制肝癌细胞的免疫进程（研究基础图3.A），低表达PNO1参与T淋巴细胞的激活（研究基础图3.B）并促进其分化（研究基础图3.C）。通过相关性分析结果验证，PNO1的表达水平与CD4+ T淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞（研究基础图3.D）、IFN-γ信号通路中的IRF6（研究基础图3.E）以及介导肝癌免疫进程的趋化因子受体CCR5（研究基础图3.F）的表达水平均呈负相关，这一系列结果均再次证实PNO1参与调控肝癌的免疫进程。
研究基础图3. 公共数据库分析初步发现PNO1参与调控肝癌细胞免疫进程 A-C. GSEA聚类分析发现PNO1介导肝癌细胞的免疫进程；D-F. 相关性分析提示PNO1表达水平与CD4+ T淋巴细胞、CD8+ T淋巴细胞、IRF6及CCR5表达水平呈负相关 （本人未发表数据）。
动物实验证实PNO1调控肝癌免疫逃逸
本人在鼠源肝癌细胞系Hep1-6中构建并验证PNO1稳定降表达（sh-PNO1）及对照组细胞系（sh-Ctrl）（研究基础图4.A）。将sh-PNO1组及sh-Ctrl组的Hep1-6细胞注射入C57BL/6皮下，第三周开始时同时处死所有小鼠（研究基础图4.B），并测量皮下肿瘤的体积。与对照组相比，sh-PNO1组的肿瘤生长速度显著降低（研究基础图4.C）。通过流式细胞学检测发现降表达PNO1组CD45+免疫细胞/CD3+ T淋巴细胞/CD8+ T淋巴细胞浸润数量增多，两组间CD4+ T淋巴细胞无显著变化（研究基础图4.D-F）。这一系列动物实验证实PNO1通过调控CD8+ T淋巴细胞影响肝癌免疫逃逸。
研究基础图4. 动物实验证实PNO1调控肝癌免疫逃逸 A. 构建并验证稳定PNO1降表达及对照组Hep1-6肝癌细胞系；B&C. 降表达PNO1组的Hep1-6肝癌细胞系皮下移植瘤体积小于对照组细胞系；D-F. 流式细胞学检测证实PNO1与CD45+免疫细胞/CD3+ T淋巴细胞/CD8+ T淋巴细胞表达水平呈负相关，与CD4+ T淋巴细胞表达水平无相关性（本人未发表数据）。
PNO1通过激活NF1以调控肝癌细胞自噬进程
本人通过TMT（Tandem Mass Tag）标记定量蛋白质组学初步筛选出PNO1降表达后显著下调的前15位蛋白，按照p值由小至大排序（|Fold Change|＞1.5，p＜0.05），发现MAPK/Erk通路调控因子NF1（研究基础图5.A）；TCGA数据库相关性分析证实NF1与PNO1显著正相关，再次验证了蛋白组学测序的结果。通过GSEA分析初步发现NF1可以调控肝癌细胞的自噬进程，相关性分析发现NF1与自噬相关蛋白Beclin1、LC3B、ATG5及ATG7表达水平密切相关（研究基础图5.B）；在HLE PNO1细胞系基础上降表达NF1，通过RT-PCR检测PNO1、NF1及自噬相关基因的表达水平，结果发现可通过下调NF1的表达水平影响PNO1介导的肝癌细胞自噬进程（研究基础图5.C）。
研究基础图5. PNO1通过激活NF1以调控肝癌细胞自噬进程 A. TMT（Tandem Mass Tag）标记定量蛋白质组学分析；B. GSEA及相关性分析探索NF1与PNO1表达水平及肝癌细胞自噬进程间的关系；C. RT-PCR证实PNO1可通过激活NF1影响肝癌细胞的自噬进程（本人未发表数据）。
动物实验证实PNO1通过调控肝癌细胞自噬影响肿瘤免疫逃逸
本人将稳定降表达PNO1及对照组Hep1-6细胞系注射至小鼠体内获得移植瘤，在对照组中加入自噬抑制剂CQ，发现加入CQ组CD8+ T淋巴细胞数目多于未加入CQ组（研究基础图6.A）。本人进一步检测了三组间MDSC的差异，加入CQ组MDSC的比例与降表达组相近，都比对照组有明显的减少（研究基础图6.B），这一结果表明靶向PNO1介导的肝癌细胞自噬可能逆转CD8+ T淋巴细胞介导的肿瘤免疫逃逸。因此本人聚焦于探索PNO1介导的肝癌细胞自噬与CD8+ T淋巴细胞间的相互关系。流式细胞学检测发现加入自噬抑制剂后，MHC-I表达水平升高（研究基础图6.C）；免疫印迹证实自噬水平的改变可以逆转MHC-I的表达水平（研究基础图6.D），生物数据库证实PNO1与MHC-I表达水平呈负相关（研究基础图6.E）。
研究基础图6. 动物实验证实PNO1通过调控肝癌细胞自噬影响肿瘤免疫逃逸 A. 自噬抑制剂CQ可以逆转PNO1介导的肝癌细胞自噬引起CD8+ T淋巴细胞数目的减少；B. 免疫抑制型细胞MDSC的比例在降表达PNO1组和加入CQ组的比例下降；C&D. 流式细胞学检测及免疫印迹证实加入CQ后MHC-I的表达水平增高. E. 生物数据库证实PNO1与MHC-I表达水平呈负相关（本人未发表数据）。
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