江苏省人民医院 胰腺中心
国际肝胆胰外科协会 （IHPBA）Kenneth Warren Fellow
Tumour Science杂志编委，主要从事胰腺癌的基础及临床转化研究。至今发表SCI论文31篇，其中10分以上SCI论文共6篇。第一作者及通讯作者SCI论文共14篇，其中10分以上4篇，累计影响因子86.5分，包括Clinical Cancer Research、JAMA Network Open、Annals of Surgery、EBioMedicine、Journal of Experimental & Clinical Cancer Research等杂志。
曾获美国胰腺病学会Young Investigator Award、江苏青年科技创新“U35创新奖”，目前主持国家自然科学基金青年基金一项。
1 前言
胰腺癌发病率逐年上升，近20年来预后并没有显著改善[1]。胰腺癌症状隐匿，缺乏针对早期病变的诊断方法，并且容易出现早期转移。胰腺癌微环境的主要特征为：异质性明显、上皮性肿瘤成分少、间质成分丰富并且缺乏效应免疫细胞，这同时也是胰腺癌预后较差的主要生物学基础。胰腺癌的预后在最近几年有了缓慢改善，目前临床应用的多药化疗方案将胰腺癌的生存期延长了数周至数月不等[2]。然而，与其他实体肿瘤相比，胰腺癌的病程并没有本质改变[3]。
2 高通量测序与胰腺癌分子分型的探索
在过去的十年中，胰腺癌相关的大规模高通量测序研究有力地推动了胰腺癌的分子分型相关研究。目前胰腺癌被公认为是连续的基因突变积累的产物。从不典型增生到浸润性癌的发展与一系列基因突变事件平行出现，包括KRAS癌基因的激活和抑癌基因CDKN2A、TP53和SMAD4的失活[4]。2008年美国约翰霍普金斯医院一项二代测序研究证实了这四个基因的突变，确定了这四个基因为胰腺癌的驱动基因[5]。研究纳入了114例转移性胰腺癌，对突变的基因进行通路分析发现，大部分胰腺癌具有12条核心信号传导通路的改变。遗憾的是，其中的大部分通路并没有相应的靶向药物针对治疗。这项研究为胰腺癌后续的分子分型奠定了基础。尽管KRAS驱动胰腺癌发生已经是公认的事实，目前仍无有效的靶向药物。近期，针对KRASG12C突变的小分子抑制剂引起了广泛关注，已有两种KRASG12C突变抑制剂被美国FDA批准用于非小细胞肺癌[6, 7]。在首个发表的KRASG12C 抑制剂单药疗法治疗晚期PDAC（胰腺导管腺癌）的临床研究中，有少数患者（21%）出现治疗反应，然而这种治疗反应通常不能持久[8]。另外，在8%–10%的KRAS野生型患者中存在所谓的“替代驱动基因”[9]。这些基因突变往往出现在较年轻（<50岁）的PDAC患者中，并且可以表现出不同的组织学特征。替代驱动基因包括ALK、TRK、RET、NRG1、BRAF、EGFR等。另外，替代驱动基因往往通过基因融合而非点突变而激活。这些患者经常会有靶向药物的使用指征，因此对于发病较年轻的PDAC[10]患者，应尽可能确定这些驱动基因的存在，特别是KRAS野生型患者。
2011年，Collisson等[11]对27个切除的胰腺癌标本以及部分人源和小鼠胰腺癌细胞系进行了全转录组测序。通过表达谱分析发现了包含62个基因的特征集，通过这一特征集可以将胰腺癌分为3种亚型：经典型、间质型和外分泌型。经典型主要高表达上皮和细胞粘附分子，并且通常分化良好。间质型则主要高表达间质相关基因，通常预后较差。外分泌型高表达消化酶相关基因。这种分型方式对预后有提示意义，即经典型预后最佳。这一模型在很多其他数据集中也得到了验证[12]。
2012年，澳大利亚昆士兰大学研究团队对99例切除的胰腺癌标本进行了全外显子组测序[13]，鉴定出的基因突变包括：KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4、MLL3、TGFBR2、ARID1A和SF3B1。值得注意的是，该研究还发现胰腺癌中存在神经轴突导向胚胎调控因子的多发体细胞突变，尤其是在SLIT/ROBO信号通路上。这一现象在小鼠模型中也得到验证，表明轴突导向基因可以参与胰腺癌的发生。2015年，该团队联合欧洲、美国开展了一项多中心测序研究[14]，对100例胰腺导管腺癌标本进行了全基因组测序和拷贝数变异（CNV）分析。研究发现，胰腺癌中普遍存在染色体重排。该研究还根据染色质结构变异的模式将PDAC分为4种亚型，具有潜在的临床应用价值。这些亚型分为稳定型（20%）、局部重排型（30%）、分散型（36%）和不稳定型（14%）。其中不稳定型与DNA修复基因（BRCA1，BRCA2和PALB2）的失活和DNA损伤修复缺陷的突变特征密切相关，同时与铂类化疗及PARP抑制剂治疗敏感性有关。
同样在2015年，美国北卡罗来纳大学Moffitt等[15]对2011年Collison[11]等的研究进行了拓展。研究纳入了145个原发灶样本和61个转移灶样本以及邻近的正常对照，新定义了2种肿瘤亚型和2种基质亚型。该研究的独特之处在于，研究人员对肿瘤、基质和相邻正常组织之间的基因表达进行了区分。确定了两种肿瘤特异性亚型（经典型和基底样型）和两种基质亚型（正常型和活化型）。活化的基质与较差的预后相关，肿瘤和基质亚型的特定组合对预后具有累积作用，其中经典型肿瘤和正常型基质的患者预后最佳。总体而言，Moffitt经典亚型与Collison经典亚型高度重叠。
在2016年，Bailey等[16]开展了一项包括456例胰腺癌切除标本的全基因组测序研究，同时分析了转录因子和下游靶标的差异表达。RNA测序分析提示所有胰腺癌样本可以聚类为4个不同的亚型：鳞状细胞型、胰腺祖细胞型、免疫原性型和内外分泌腺异常分化型（ADEX）。鳞状细胞型的TP53和KDM6A突变数量最多，预后最差。胰腺祖细胞型表达的基因与胰腺发育有关，并富含TGFBR2的失活突变。免疫原性型的特点是显著的免疫浸润和抑制性免疫检查点通路的上调。ADEX型的特点是参与胰腺外分泌和内分泌细胞发育后期阶段的基因高表达。将该转录组测序分型方式与Collison分型进行比较时，除了添加了免疫原性亚型外，其他三种与Collison分型存在明显的重叠。Collison间质型对应于鳞状细胞型，经典型对应于胰腺祖细胞型，外分泌型对应于ADEX型。Moffitt分型则与和Bailey分型之间的相似性较低，这可能是由于后者研究中的肿瘤间质含量降低所致。
针对PDAC肿瘤微环境中癌细胞比例较低所带来的限制，2018年Puleo等人开展了基于激光捕获显微切割（LCM）技术的胰腺癌测序研究。该研究分别收集了组织中的上皮或基质富集区域并测序，确定了五种亚型，分别为：纯基底样型、间质激活型、促纤维增生型、纯经典型和免疫经典型。该研究发现Bailey分型中的ADEX亚型很可能是由于胰腺腺泡细胞的污染导致[17]。
2020年，Chan-Seng-Yu等开展了另一项大规模胰腺癌测序研究[18]。该团队对晚期PDAC患者的癌细胞进行了微切割富集，并将全基因组测序和转录组测序数据相结合，鉴定出PDAC的五种不同亚型：基底样型A、基底样型B、混合型、经典型A和经典型B。此外，通过将这些亚型与单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据相关联，他们证明在单个肿瘤中可以有不同的亚型共存，表明了胰腺癌肿瘤内部的复杂异质性。
以上研究提示，转录组测序以及全基因组、全外显子测序证实了胰腺癌中存在生物学亚型。Collison、Moffitt和Bailey分型之间有较强的生物学相似性。一般而言，间质型/鳞状细胞型/基底样型的预后比经典型/胰腺祖细胞亚型的预后差，并且对化疗的敏感性可能更高。胰腺癌分子分型研究的重要进展为后续胰腺癌个体化治疗奠定了重要基础。
3 基因检测与胰腺癌个体化治疗
1990年，当人类基因组计划启动时，其目标是对整个人类基因组进行测序。它开创了临床医学的新纪元，即疾病的基因基础可以用来指导临床实践[19]。这场革命的核心理念是：对疾病基因基础更深入的了解可以促进更有针对性的疗法的开发。精准医学的定义为：在人群数据的基础上，通过基因组信息，环境或社会学特征对个体进行分类，确定针对某些因素的特定疗法[19]。简言之，即 “在正确的时间为正确的患者提供正确的治疗”。近十年来，包括测序在内的基因组技术成本的迅速下降和生物公司的爆炸性增长，使得精准医学的理念迅速走向临床，并且显著改善了肿瘤患者的预后。
与基因组测序技术的飞速发展相吻合，胰腺癌治疗药物的开发方面也取得了显著进展。在过去的十年中，胰腺癌患者的化疗药物选择已从单药吉西他滨发展到多药疗法，例如5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂（FOLFIRINOX）和吉西他滨/白蛋白紫杉醇，已被证明可以延长总生存期（OS）[20, 21]。有研究报道，在采用多药方案的患者中在同源重组DNA修复通路中存在遗传缺陷的患者应答率较高[22]。其可能的机制为铂类药物可引起DNA交联并诱导DNA链断裂，而DNA链断裂则无法在DNA修复缺陷的细胞（例如BRCA1和BRCA2突变的细胞）中修复。除了基于铂类药物的疗法外，存在DNA修复缺陷的肿瘤还对PARP抑制剂具有更高的敏感性，后者针对的是DNA修复通路和细胞凋亡所必需的ADP核糖基化。在一项研究中[23]，9位BRCA突变患者接受了PARP抑制剂联合吉西他滨和顺铂的化疗，其中有5位患者表现出部分缓解，其余4位患者则表现为病情稳定无进展。而近期的POLO研究则表明，在一线铂类化疗后无疾病进展的BRCA突变晚期胰腺癌患者中，使用PARP抑制剂奥拉帕利可以显著延长无进展生存期[24]。2020年美国NCCN指南也随即更新建议：建议胰腺癌患者进行BRCA1/2胚系突变检测，对于BRCA1/2突变胰腺癌患者，如果在一线铂类化疗过程中疾病无进展，推荐使用奥拉帕利维持治疗[25]。然而，POLO研究更长的随访数据并未显示出奥拉帕利维持治疗后的OS改善[26]。尽管如此，PARP抑制剂在临床上仍有一定的应用价值，这主要是由于“无化疗”治疗方案对患者生活质量的改善。以上研究表明，胰腺癌之间的组织病理学相似性掩盖了潜在的基因组多样性，如果充分理解，它可以用来更好地将患者进行分组并运用特定的靶向药物。
胰腺癌分子分型相关研究进展迅速，但是研究成果转化为临床实践尚需时间。IMPaCT（Individualized Molecular Pancreatic Cancer Therapy）临床试验是第一个针对胰腺癌的精准治疗临床试验[27]。研究纳入了76例转移和复发胰腺癌患者，检测内容包括BRCA1/2、PALB2、ATM或KRAS基因的靶向测序以及石蜡切片中HER2表达情况。检测到异常的患者随机分配至单药吉西他滨或靶向治疗。同源重组DNA修复缺陷的患者接受5-氟尿嘧啶和丝裂霉素C，HER2扩增的患者接受吉西他滨和曲妥珠单抗，野生型KRAS患者接受吉西他滨和厄洛替尼。22位（28%）患者中检测到了治疗靶点（14位野生型KRAS，5位HER2扩增，2位BRCA2和1位ATM突变）。获得检测结果的中位时间为21.5天。然而没有患者在该试验中得到成功治疗。这表明如何在临床实践中缩短检测结果回复时间极为重要。
COMPASS（Comprehensive Molecular Characterization of Advanced Pancreatic Ductal Adenocarcinoma for Better Treatment Selection）临床试验另一项基于测序的胰腺癌精准治疗临床试验[28]。在该试验中，63例晚期胰腺癌患者接受了肿瘤活检和全基因组测序，并对新鲜肿瘤组织中进行了RNA测序。该试验的主要研究终点是在8周之内报告测序结果的可行性。该研究在18例（28%）患者中检测到可以针对治疗的突变，其中5例ARID1A突变，一例BRAF突变，4例CDK4/6突变，4例PIK3CA突变，3例PTEN突变以及2例FNG43突变。从活检至测序报告回复中位时间为35天。有5例患者根据COMPASS试验测序结果进行了二线治疗。该研究根据Moffitt分型对肿瘤进行了分类，并根据分子亚型比较了对一线化疗的反应。他们观察到接受FOLFIRINOX治疗的经典型患者的无进展生存期得到改善。此外，该研究还发现GATA6蛋白表达是区分经典型和基底样型的有力替代生物标志物，表明简单的蛋白质组学检测有希望替代全基因组测序指导治疗。
“Know Your Tumor Initiative（认识你的肿瘤）”研究计划是美国胰腺癌行动网络与美国知名癌症个体化治疗公司Perthera公司之间的合作项目，旨在为患者提供胰腺癌多组学信息[29]。纳入患者的胰腺癌样本接受了二代测序和免疫组化检测。研究最终纳入了640份肿瘤标本，其中591例为胰腺癌。检测报告获取中位时间为30天。多学科专家组在50%的患者中发现了可作为潜在治疗靶点的突变，其中27%的患者的治疗靶点应用价值较高。5%的患者中发现了有潜在治疗价值的蛋白质组学改变。治疗价值较高的突变包括同源重组DNA修复通路（15％）突变、细胞周期相关基因（11%）突变和AKT/mTOR通路（19%）突变。640位患者中有156位（24%）根据检测结果更改了治疗方案。亚组分析提示：检测到治疗靶点突变的患者（n=17）在更换治疗方案后，与未得到匹配靶向治疗的患者（n=18）相比，无进展生存期明显延长（HR=0.47，p=0.003）。
2020年3月，该研究的最新结果发表在Lancet Oncology杂志上[30]。该研究在2014年至2019年纳入了1856例胰腺癌患者，有1082例（58％）患者根据其分子检测结果收到了个性化检测报告。在1082名患者中的282名（26％）中发现了可针对治疗的分子改变。在有随访数据的677例患者中，有189例具有可针对治疗的分子改变。中位随访期为383天（IQR 214~588），接受匹配的靶向疗法（n = 46）的具有可治疗靶点患者的中位OS比仅接受不匹配疗法的患者（n=143）相比明显延长（2.58年 vs 1.51年）。与没有发现可治疗靶点的488例患者相比，接受匹配疗法的46例患者的OS显著延长（2.58 vs 1.58年）。但是，未接受相匹配的靶向治疗的患者和没有可治疗靶点的患者的中位OS则没有差异。这项真实世界研究提示：准确应用靶向药物可以对胰腺癌患者的生存产生重大影响。针对驱动基因突变以及DNA损伤反应和修复通路的分子靶向治疗值得进一步的前瞻性评估。
以上的临床试验结果表明，基于测序的精准治疗模式对胰腺癌有一定的应用价值。其难点主要在于构建高效的“基因检测-治疗决策”的临床路径。IMPaCT临床试验的研究者们总结了胰腺癌精准治疗模式建立的关键因素：1. 足够的患者数量；2. 标准化的样本取材；3. 检测周期满足治疗时间窗；4. 临床试验设计需考虑患者需求。
4讨论与展望
在过去的20年中，基因组学的发展为肿瘤发生、发展的基因基础提供了重要信息。二代测序目前已经渗透到肿瘤研究的各个方面。对每个癌症患者的基因组信息和表观基因组信息进行个体化解读，把胚系和体细胞的变异结合考虑，将从根本上改变肿瘤生物学研究模式。简单地根据基因突变决定治疗方式忽略了肿瘤生物学的复杂性。肿瘤在发生过程中获得了许多基因组改变，这些改变有助于其进展，也可以使其易于治疗。这些改变也包括甲基化和组蛋白修饰等表观遗传变化。这些变化不能仅通过DNA测序获取，取而代之的是，RNA测序揭示了癌症生物学的许多其他方面，这些方面是由基因组和表观基因组的组合变化引起的，包括通路上调和药物可靶向的蛋白的过表达。因此，仅针对特定基因的特定突变开展临床试验过于简单，未来我们需要将肿瘤的综合基因组测序数据整合到临床决策中。我们也注意到，三代测序、单细胞测序、空间转录组测序在癌症研究中的应用也逐渐开展。其技术层面对二代测序的弥补可以使我们对肿瘤基因组的认识更加全面，并将在接下来的几年中促使胰腺癌重大研究突破的出现。
[1]. 郑荣寿, 孙可欣, 张思维, 曾红梅, 邹小农, 陈茹, et al. 2015年中国恶性肿瘤流行情况分析[J]. 中华肿瘤杂志. 2019;41(1):19-28.
[2]. Wang-Gillam A, Li C-P, Bodoky G, Dean A, Shan Y-S, Jameson G, et al. Nanoliposomal irinotecan with fluorouracil and folinic acid in metastatic pancreatic cancer after previous gemcitabine-based therapy (NAPOLI-1): a global, randomised, open-label, phase 3 trial[J]. The Lancet. 2016;387(10018):545-57.
[3]. Noone A, Howlader N, Krapcho M, Miller D, Brest A, Yu M, et al. SEER cancer statistics review, 1975-2015[J]. Bethesda, MD: National Cancer Institute. 2018.
[4]. Feldmann G, Beaty R, Hruban RH, Maitra A. Molecular genetics of pancreatic intraepithelial neoplasia[J]. Journal of Hepato‐Biliary‐Pancreatic Surgery. 2007;14(3):224-32.
[5]. Jones S, Zhang X, Parsons DW, Lin JC-H, Leary RJ, Angenendt P, et al. Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by global genomic analyses[J]. science. 2008;321(5897):1801-6.
[6]. Hong DS, Fakih MG, Strickler JH, Desai J, Durm GA, Shapiro GI, et al. KRASG12C inhibition with sotorasib in advanced solid tumors[J]. New England Journal of Medicine. 2020;383(13):1207-17.
[7]. Jänne PA, Riely GJ, Gadgeel SM, Heist RS, Ou S-HI, Pacheco JM, et al. Adagrasib in non–small-cell lung cancer harboring a KRASG12C mutation[J]. New England Journal of Medicine. 2022;387(2):120-31.
[8]. Strickler JH, Satake H, George TJ, Yaeger R, Hollebecque A, Garrido-Laguna I, et al. Sotorasib in KRAS p. G12C–mutated advanced pancreatic cancer[J]. New England Journal of Medicine. 2023;388(1):33-43.
[9]. Singhi AD, George B, Greenbowe JR, Chung J, Suh J, Maitra A, et al. Real-time targeted genome profile analysis of pancreatic ductal adenocarcinomas identifies genetic alterations that might be targeted with existing drugs or used as biomarkers[J]. Gastroenterology. 2019;156(8):2242-53. e4.
[10]. Philip PA, Azar I, Xiu J, Hall MJ, Hendifar AE, Lou E, et al. Molecular characterization of KRAS wild-type tumors in patients with pancreatic adenocarcinoma[J]. Clinical Cancer Research. 2022;28(12):2704-14.
[11]. Collisson EA, Sadanandam A, Olson P, Gibb WJ, Truitt M, Gu S, et al. Subtypes of pancreatic ductal adenocarcinoma and their differing responses to therapy[J]. Nature medicine. 2011;17(4):500.
[12]. Balagurunathan Y, Morse DL, Hostetter G, Shanmugam V, Stafford P, Shack S, et al. Gene expression profiling-based identification of cell-surface targets for developing multimeric ligands in pancreatic cancer[J]. Molecular cancer therapeutics. 2008;7(9):3071-80.
[13]. Biankin AV, Waddell N, Kassahn KS, Gingras M-C, Muthuswamy LB, Johns AL, et al. Pancreatic cancer genomes reveal aberrations in axon guidance pathway genes[J]. Nature. 2012;491(7424):399-405.
[14]. Waddell N, Pajic M, Patch A-M, Chang DK, Kassahn KS, Bailey P, et al. Whole genomes redefine the mutational landscape of pancreatic cancer[J]. Nature. 2015;518(7540):495-501.
[15]. Moffitt RA, Marayati R, Flate EL, Volmar KE, Loeza SGH, Hoadley KA, et al. Virtual microdissection identifies distinct tumor-and stroma-specific subtypes of pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Nature genetics. 2015;47(10):1168.
[16]. Bailey P, Chang DK, Nones K, Johns AL, Patch A-M, Gingras M-C, et al. Genomic analyses identify molecular subtypes of pancreatic cancer[J]. Nature. 2016;531(7592):47-52.
[17]. Puleo F, Nicolle R, Blum Y, Cros J, Marisa L, Demetter P, et al. Stratification of pancreatic ductal adenocarcinomas based on tumor and microenvironment features[J]. Gastroenterology. 2018;155(6):1999-2013. e3.
[18]. Chan-Seng-Yue M, Kim JC, Wilson GW, Ng K, Figueroa EF, O’Kane GM, et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution[J]. Nature genetics. 2020;52(2):231-40.
[19]. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, et al. Initial sequencing and analysis of the human genome[J]. 2001.
[20]. Conroy T, Desseigne F, Ychou M, Bouché O, Guimbaud R, Bécouarn Y, et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer[J]. New England Journal of Medicine. 2011;364(19):1817-25.
[21]. Von Hoff DD, Goldstein D, Renschler MF. Albumin-bound paclitaxel plus gemcitabine in pancreatic cancer[J]. The New England journal of medicine. 2014;370(5):479.
[22]. Kaufman B, Shapira-Frommer R, Schmutzler RK, Audeh MW, Friedlander M, Balmaña J, et al. Olaparib monotherapy in patients with advanced cancer and a germline BRCA1/2 mutation[J]. Journal of clinical oncology. 2015;33(3):244.
[23]. O'Reilly EM, Lowery MA, Segal MF, Smith SC, Moore MJ, Kindler HL, et al. Phase IB trial of cisplatin (C), gemcitabine (G), and veliparib (V) in patients with known or potential BRCA or PALB2-mutated pancreas adenocarcinoma (PC). American Society of Clinical Oncology; 2014.
[24]. Golan T, Hammel P, Reni M, Van Cutsem E, Macarulla T, Hall MJ, et al. Maintenance olaparib for germline BRCA-mutated metastatic pancreatic cancer[J]. The New England journal of medicine. 2019.
[25]. MS JLH. Guiding Better Pancreatic Cancer Care: New NCCN recommendations to test all pancreatic cancer patients highlight the value of providers and genetic counselors working together to improve care[J]. Clinical OMICs. 2020;7(1):36-8.
[26]. Kindler HL, Hammel P, Reni M, Van Cutsem E, Macarulla T, Hall MJ, et al. Overall survival results from the POLO trial: a phase III study of active maintenance olaparib versus placebo for germline BRCA-mutated metastatic pancreatic cancer[J]. Journal of Clinical Oncology. 2022;40(34):3929-39.
[27]. Chantrill LA, Nagrial AM, Watson C, Johns AL, Martyn-Smith M, Simpson S, et al. Precision medicine for advanced pancreas cancer: the individualized molecular pancreatic cancer therapy (IMPaCT) trial[J]. Clinical cancer research. 2015;21(9):2029-37.
[28]. Aung KL, Fischer SE, Denroche RE, Jang G-H, Dodd A, Creighton S, et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: early results from the COMPASS trial[J]. Clinical Cancer Research. 2018;24(6):1344-54.
[29]. Petricoin EF, Brody JR, Sohal D, Hendifar AE, Halverson DM, Matrisian LM, et al. Molecular Profiling of Pancreatic Cancer Patients: Initial Results from the Know Your Tumor Initiative[J]. Clinical Cancer Research. 2018.
[30]. Pishvaian MJ, Blais EM, Brody JR, Lyons E, DeArbeloa P, Hendifar A, et al. Overall survival in patients with pancreatic cancer receiving matched therapies following molecular profiling: a retrospective analysis of the Know Your Tumor registry trial[J]. The Lancet Oncology. 2020.
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