【35under35】徐贻佺医生：探索细胞周期关键因子调变介导非小细胞肺癌脑膜转移的新机制及临床应用

总体思路：非小细胞肺癌脑膜转移预后差、缺乏有效治疗手段，基于临床这一棘手问题，我们基于前期发现--细胞周期关键因子变异调变在脑膜转移中可能起到重要作用，拟进一步通过基础研究探索细胞周期关键因子调变介导非小细胞肺癌脑膜转移的新机制，最后开展临床研究进行验证，以期为脑膜转移治疗提供新的治疗方案。

1.研究背景
1.1非小细胞肺癌脑膜转移诊疗现状及亟待解决的问题
肺癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位列所有癌症的首位，脑膜是晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）常见的转移部位，发生率约10%[1]。尽管靶向治疗是驱动基因阳性NSCLC脑膜转移的主要治疗手段之一，但多数患者最终均发生耐药，中位生存期仅为3-10个月[1]。鉴于NSCLC脑膜转移具有进展快、预后差且临床缺乏有效治疗手段，全面深入探索NSCLC脑膜转移机制对于寻找潜在的治疗靶点具有重大意义。
1.2 脑膜转移机制的研究现状及尚未解决的问题
对于恶性肿瘤的转移机制有多种假说，其中以1889年Stephen Paget提出的“种子-土壤学说”较为著名[2]，肿瘤转移是肿瘤细胞（“种子”）与微环境（“土壤”）双向动态作用的结局，例如肺癌和乳腺癌细胞可以通过上调补体C3水平激活脉络膜丛上皮中的C3a受体，破坏血-脑脊液屏障，导致血浆成分中双调节蛋白和其他有丝分裂原进入脑脊液，进而促进癌细胞生长[3]。2020年，发表在《Science》上的一项研究发现脑脊液中肺腺癌和乳腺癌细胞高表达铁结合蛋白脂钙素-2（LCN2）及其受体SCL22A17，LCN2促进肿瘤细胞在脑膜中生长，而脑脊液中巨噬细胞产生的炎性细胞因子又诱导LCN2的表达，进一步促进肺腺癌和乳腺癌细胞的生长[4]。这些重磅研究结果充分说明肿瘤细胞（“种子”）与脑膜脑脊液微环境（“土壤”）双向动态作用是引发脑膜转移的核心要素。因此，只有从肿瘤细胞本身生物学特性改变及肿瘤微环境重塑特征两个方面全面认识NSCLC脑膜转移的内在实质，才能为临床诊疗提供更有价值的理论基础和实践思路。
关于NSCLC脑膜转移的机制的研究文献报道十分有限，目前主要存在以下不足：①缺乏可靠稳定的动物模型；②大多数研究仅仅从“种子”或“土壤”单个角度，未从免疫微环境及肿瘤细胞双向作用机制全面解析；③临床研究数据多来源于单一的时间节点和单一组织类型，缺乏动态分析数据。
1.3 细胞周期关键因子调变参与NSCLC脑膜转移的潜在机制及其作为潜在治疗靶点的探索
（1）NSCLC脑膜转移富集细胞周期关键调控基因异常
细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase, CDK）形成异二聚体，通过CDK活性调节不同底物磷酸化，从而实现细胞周期的调控。细胞周期异常调控是恶性肿瘤常见的生物学特征之一，大规模基因组学结果显示，在NSCLC的细胞周期调控中，常发生变异的细胞周期通路核心基因主要包括BTG2、CCND1、CDK12、CDK4、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A和RB1等[5-6]。
以往对细胞周期关键因子的研究热点聚焦于细胞周期调控。联合课题组前期通过脑膜转移大数据平台进行脑膜转移的基因组学特征分析^[7]，目前更新的研究结果发现脑膜转移富集细胞周期关键调控基因异常：①发生脑膜转移与无脑膜转移患者相比，细胞周期关键调控基因的异常表型发生率显著增高（69% vs. 33%）；②在脑膜转移的患者中，脑脊液和配对的外周病灶对比，细胞周期关键调控基因的异常表型发生率同样显著增高（60.0% vs. 27.6%）；③高频突变的细胞周期关键调控基因分布在外周和脑膜转移灶有着明显区别，CDKN2A/CDKN2B基因拷贝数缺失为脑膜转移患者最常见的异常基因；而在外周病灶中CDKN2A/CDKN2B基因拷贝数缺失占比很少，RB1缺失发生率最高；④CDKN2A/CDKN2B基因拷贝数缺失是脑膜转移患者独立的预后因素（参阅前期研究基础4）。这些现象强烈提示细胞周期关键因子异常并不是仅仅局限于细胞周期调控这个作用，在调控肺癌脑膜转移中可能扮演极其重要的作用，充当着“种子”的角色。
（2）携带细胞周期关键调控基因异常表型的肺癌细胞（种子）与脑膜微环境（土壤）是如何相互作用？
细胞周期因子究竟通过改变肿瘤细胞（“种子”）的哪些生物学特性，继而使得其获得脑膜转移潜能和亲脑膜生物学特性？联合课题组前期从基因组学层面分析肺癌中枢神经系统转移肿瘤的克隆演化，发现细胞周期关键分子发生调变很可能是该转移进程的早期关键事件（详见前期研究基础5）。目前已有一些研究表明细胞周期关键因子改变可影响肿瘤细胞侵袭及转移等生物学特征。例如Sun等研究发现CDKN2A突变通过选择性剪切方式调控P16/p14的表达并促进肾细胞癌的转移[8]。在TP53缺失的三阴性乳腺癌中，细胞周期关键分子BTG2的表达缺失可增强癌细胞的增殖与转移能力[9]。另外，联合课题组在前期应用单细胞测序技术发现，与原发灶中肿瘤细胞形成明显对比，在脑膜转移患者的脑脊液肿瘤细胞中ICAM黏附因子互作很强，且与多种细胞类型之间都存在该互作对，结果提示细胞周期关键调控基因有可能通过调节黏附因子促进肿瘤细胞在脑脊液中的定植（详见前期研究基础6）。
从脑膜微环境（土壤）的角度，目前已知脑膜并不是免疫豁免区，生理条件下脑膜含有多种免疫细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞、固有淋巴细胞、肥大细胞、中性粒细胞、B细胞和T细胞等[10]。在恶性肿瘤中枢神经系统转移病灶中已经发现有肿瘤特异性淋巴细胞的浸润[11-12]，免疫检查点抑制剂单药在脑膜转移患者中具有一定疗效[13-14]。目前关于NSCLC 脑膜转移患者的脑膜免疫微环境的研究报道仍然极其有限。联合课题组前期利用单细胞测序技术分析NSCLC脑膜转移患者的免疫微环境特征，结果提示：脑膜转移患者与非肿瘤患者、配对原发病灶的肿瘤免疫微环境存在明显差异，脑膜转移患者脑脊液免疫细胞组成以单核细胞为主体，占比50%-95%，NK细胞基本消失。此外，还发现一类巨噬细胞亚群为脑转移病灶所特有，并且显著高表达TFF1和TFF3基因（一类肿瘤细胞播撒标志物）（详见前期研究基础7和8）。据此，我们推测脑膜免疫微环境的重塑很可能是参与肺癌脑膜转移过程中的关键限制因素。
另一方面，已有研究表明，细胞周期关键基因从抗原递呈、肿瘤特异性淋巴细胞浸润、调控PD-L1负性因子的表达等多个角度广泛参与肿瘤免疫微环境的重塑。比如CDK12基因拷贝缺失的前列腺癌组织显示出以Treg细胞富集为特征的免疫抑制微环境[15]；抑制CDK4/6活性也可增强肿瘤抗原的呈递、抑制调节性T细胞 (Tregs)、增强CD8+T细胞的杀伤作用及促进CD8+T细胞记忆形成[16-17]；另外，CDK5及CDK4/6还可以上调肿瘤细胞PD-L1分子的表达而介导免疫逃逸[18-19]。上述这些研究结果均提示肿瘤细胞的细胞周期关键因子调变很可能参与了肿瘤转移灶免疫微环境的重塑过程，“种子”与“土壤”可能存在密切的相互作用关系。
（3）细胞周期关键因子调变是否可以成为脑膜转移治疗干预的潜在靶点？
目前脑膜转移主要治疗药物包括鞘内化疗、靶向治疗和免疫治疗。其中，靶向治疗又扮演了极其重要的角色，本项目组前期发现绝大多数NSCLC脑膜转移患者存在驱动基因突变，驱动基因野生型患者罕见，文献报道其中高达73%-87%的患者存在表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）突变[20-21]。EGFR-TKI是这类患者的主要治疗手段之一，但几乎所有EGFR阳性的脑膜转移患者在多程治疗后均发生靶向药物耐药，我们称为难治性脑膜转移，目前缺乏有效治疗靶点和手段，是制约脑膜转移患者长生存的重要原因。
挖掘新的潜在治疗靶点仍是临床迫切需求。不断有研究证据提示，细胞周期关键分子调变不单是在脑膜转移过程中扮演了重要角色，也参与了EGFR-TKI获得性耐药过程。多个研究结果和本联合课题组发现细胞周期关键基因突变是奥希替尼外周和中枢神经系统继发性耐药的常见机制之一[7, 21-23]（详见前期研究基础2）。与我们研究结果相呼应的是，一些体外研究也证实细胞周期关键调控基因表型异常CCND1/CCND2、CCNE1、CDK4/6扩增以及CDKN2A/2B缺失等可导致EGFR-TKI继发性耐药[24-25]。需要重复的是，如前所述，在细胞周期调控异常介导EGFR-TKI获得性耐药中，联合课题组前期研究发现高频突变的细胞周期关键调控基因分布在外周和脑脊液有着明显区别，CDKN2A/2B基因拷贝数缺失为脑脊液最常见的异常基因，而在外周病灶中主要是RB1缺失。这个现象强烈提示我们：针对细胞周期通路异常的CDK4/6抑制剂在外周和脑膜转移的EGFR-TKI继发性耐药的疗效很可能存在本质的区别。CDKN2A/B、CDK4/6、RB1基因是细胞周期从G1期到S1期的关键调控因子，CDKN2A/B位于该信号途径上游，通过编码p16INK4A蛋白，与CyclinD竞争性结合CDK4/6，抑制CDK4/6的激酶活性，而RB1基因是CDK4/6活化后磷酸化的底物[26-27]。大量体外基础研究表明：CDKN2A/B缺失或CDK4/6扩增提示CDK4/6抑制剂有效，而RB1突变往往提示对CDK4/6抑制剂无反应[26-27]。根据这一理论，课题组前期采用阿贝西利（一种CDK4/6抑制剂）联合奥希替尼试验性治疗一例EGFR-TKI继发性耐药的脑膜转移患者，颅内病灶出现显著缩小，这个个案强烈提示CDK4/6抑制剂逆转EGFR-TKI耐药具有进一步探索的前景（详见前期研究基础9）。
免疫治疗已经成为脑膜转移的一个新的重要治疗手段，如前所述，细胞周期关键基因从抗原递呈、肿瘤特异性淋巴细胞浸润、调控PD-L1负性因子的表达等多个角度广泛参与肿瘤免疫微环境的重塑。有证据显示CDK4/6抑制剂可刺激III型干扰素的产生，从而增强肿瘤抗原的呈递、增加肿瘤浸润和效应T细胞的活化，并且可以促进CD8+T细胞记忆形成；CDK4/6抑制剂还可以通过显著抑制调节性T细胞 (Tregs)、增强CD8+T细胞的杀伤作用来增强抗肿瘤作用^[17, 28]。因此，有必要在明确具体机制的基础上，进一步开展临床试验验证细胞周期调节剂与免疫抑制剂是否存在联合增效的作用。
综上所述，本研究将在前期研究基础的背景下，着眼于细胞周期关键因子，从基础和临床两个方面，深入探索其介导NSCLC脑膜转移潜能、亲脑膜生物学特性及介导免疫逃逸机制，阐明细胞周期关键因子调变和脑膜微环境相互作用的新机制，探明靶向细胞周期关键分子逆转EGFR-TKI继发性耐药机制，开发CDK4/6抑制剂联合靶向或免疫治疗的临床应用潜力，以期为脑膜转移的精准治疗和管理提供理论基础，提高疗效，改善患者的生存预后。

2．研究内容
（1）分析细胞周期关键因子介导脑膜转移潜能
通过完善国内多中心NSCLC脑膜转移大数据平台并通过基因组学检测筛选出亲脑膜转移细胞周期关键因子；随后，进一步选择初步筛选的细胞周期关键基因，构建细胞周期关键因子表达水平不同的细胞株、构建肺癌脑膜转移动物模型，分析细胞周期关键因子调变前后肿瘤细胞脑膜转移能力的改变。
（2）研究细胞周期关键因子调变诱导肿瘤细胞亲脑膜生物学特性及介导脑膜转移潜在机制
系统全面分析细胞周期关键因子调变后肿瘤细胞迁移及侵袭能力、干性、EMT改变以及EGFR敏感性变化等，另外重新恢复细胞周期关键因子表达，检测细胞干性、EMT改变以及EGFR敏感性是否恢复；揭示细胞周期关键因子介导脑膜转移的可能环节及机制；利用多组学技术描绘脑膜转移克隆时空演变全景图，分析细胞周期关键调变因子在推动肿瘤异质性、干性分子、上皮间质转化、脑膜潜在特异性黏附分子表达调控以及EGFR-TKI耐药等影响。全面阐明细胞周期关键因子调变诱导肿瘤细胞亲脑膜生物学特性及介导脑膜转移潜在机制。
（3）探索细胞周期关键分子介导肿瘤免疫逃逸机制
通过多组学技术描绘细胞周期关键因子调变介导脑膜免疫微环境变化的全景图，进一步通过脑膜转移动物模型动态监测细胞周期关键因子调控脑膜免疫微环境、体外细胞共培养分析细胞周期关键因子对免疫细胞的作用机制等实验；共同揭示细胞周期关键分子介导肿瘤免疫逃逸的具体机制。
（4）探讨靶向细胞周期关键分子联合免疫治疗NSCLC脑膜转移的协调机制及联合策略
利用体外实验研究细胞周期关键因子抑制剂联合免疫治疗或联合靶向治疗的方案、疗效分析及协同机制；在此基础上，开展Ib/II期前瞻性临床研究探索CDK4/6抑制剂联合靶向治疗或免疫治疗的疗效及安全性，共同阐明靶向细胞周期关键因子联合靶向或免疫治疗的联合策略可行性及协同机制。

3．拟采取的研究方案
【总体的研究思路和框架】

备注：蓝色字体为临床研究内容，绿色为基础研究内容；研究数据后续使用方向

【拟采取的研究方案】
3.1分析细胞周期关键因子介导脑膜转移潜能
3.1.1持续完善国内多中心NSCLC脑膜转移大数据平台。
完善平台合作共赢机制；完善随访制度，提高数据质量；并进一步扩大合作单位的数量。

图1-3-A1 国内多中心NSCLC脑膜转移大数据平台建设示意图

3.1.2基因组学筛选NSCLC脑膜转移细胞周期关键因子。
（一）利用建立的脑膜转移大数据平台中心，通过基因组测序，筛选NSCLC脑膜转移细胞周期关键因子
（1）研究人群：分为两部分。第一部分收集NSCLC脑膜转移患者100例，获取每个患者转移前肺原发肿瘤组织、转移后肺原发肿瘤组织脑脊液（CSF）配对样本。纳入标准：1）年龄≥18岁；2）经脑脊液细胞学病理证实为NSCLC脑膜转移或临床诊断为NSCLC脑膜转移：影像学典型表现和症状体征3）临床资料和随访资料齐全。第二部分收集NSCLC无脑膜转移患者肺原发肿瘤组织100例。
（2）进行二代测序：①核酸提取与检测；②文库构建与文库检测：末端修饰、添加接头、磁珠纯化、PCR扩增、第二次磁珠纯化、质量检测；③上机测序：Illumina平台；④数据分析。
（二）利用公共数据库分析细胞周期关键因子在NSCLC中枢神经系统转移的调变情况
（1）收集、下载公共数据库NSCLC脑膜转移数据集。
（2）数据分三组：原发肺肿瘤、脑膜转移以及正常肺组织数据。
（3）分析细胞周期关键基因在三组间的差异。
整合大数据平台和公共数据库，综合分析筛选出亲脑膜转移的细胞周期关键因子。

图1-3-A2 基因组学检测筛选NSCLC脑膜转移细胞周期关键因子技术路线图

3.1.3明确具有调控NSCLC脑膜转移潜能的细胞周期关键因子组成及类别。
根据前期基础中筛选的细胞周期关键因子，包括Rb1、CDK4/6及 CDKN2A/B的表达缺失等，我们通过体内外实验进一步明确这些分子介导肺癌脑膜转移的潜能。
3.1.3.1 筛选并构建用于本项目研究的肺癌细胞株
首先根据 CCLE （Cancer Cell Line Encyclopedia）肿瘤细胞株数据库初步分析结果（基础研究10）确定拟用于后续研究的肺癌细胞株，包括人NSCLC细胞株（A549、HCC827、H1299、NCIH1666、NCIH23及PC9等）及C57BL/6小鼠 来源的Lewis肺癌细胞系LLC等。其次，通过qPCR方法及Western blot方法检测上述细胞株细胞周期关键因子Rb1、CDK4、CDK6 CDKN2A及CDKN2B mRNA 表达水平及蛋白表达水平。再次，根据各肿瘤细胞特征构建相应的细胞株，如HCC827、PC9及LLC拟用于构建EGFR-TKI诱导的耐药细胞株（HCC827、PC9及LLC均为 EGFR19del突变的敏感株），药物浓度递增法诱导并构建吉非替尼或奥希替尼耐药株A549及NCIH1666拟用于构建CDKN2A/2B过表达细胞株（亲本细胞CDKN2A/2B低表达）采用CRISPR/Cas9基因敲除技术 构建 CDKN2A/2B敲除细胞株（HCC827及PC9细胞CDKN2A/2B高表达）。确定用于体内研究的细胞株种类，通过腺病毒感染将荧光素酶基因导入人或小鼠肺癌细胞中，构建带有荧光素酶luc基因的亲代肿瘤细胞。
3.1.3.2原位脑膜瘤模型比较细胞周期关键因子表达不同细胞株成瘤率的差异
构建原位脑膜瘤模型，观察成瘤率：①比较分析细胞周期关键基因表达不同细胞株脑膜成瘤率的差别：分别将成对的肺癌细胞株（靶基因敲除或过表达细胞株及其对照细胞）注射到成年裸鼠小脑延髓池中，构建原位脑膜瘤，每隔一周用活体成像仪观察小鼠脑膜成瘤情况，对比分析不同细胞株的成瘤率。②观察耐药前后细胞周期关键因子调变对其脑膜成瘤率的影响：选取免疫功能正常C57BL/6小鼠，摸索LLC-luc（耐药株与敏感株）接种的剂量及成瘤率。
3.1.3.3 构建脑膜转移驯化模型验证细胞周期关键因子调变后的脑膜成瘤情况
（1）脑膜转移驯化模型的构建
选取成年裸鼠或C56BL/6小鼠，在脑立体定位仪的辅助下，暴露小鼠颅骨，磨出颅窗，使用微量进样针将亲代肿瘤细胞（PC9或LLC）注射到脑膜中，待小鼠出现活动不协调及体重骤减等成瘤症状时，处死小鼠，取出脑膜肿瘤细胞，进行体外培养，此即1代驯化肿瘤细胞，将此细胞按同样操作再次注射到小鼠脑膜中，成瘤后取出培养，即2代驯化细胞，如此循环3-5次，直至得到的驯化细胞注射到小鼠颈动脉后经血液播散在脑膜的成瘤率达80%以上，即为脑膜驯化肿瘤细胞。将此细胞进行颈动脉注射，并利用活体成像监测成瘤情况，即为构建的脑膜转移驯化模型。
（2）分析亲代肿瘤细胞与脑膜驯化肿瘤细胞中细胞周期关键因子的变化
对以上两株细胞进行基因测序分析，着重对比驯化前后细胞周期关键因子的表达、富集或突变情况，从而明确细胞周期关键因子对肿瘤细胞亲脑膜性的影响。
（3）基因改造驯化的肿瘤细胞
在基因测序的基础上通过基因敲除或过量表达，调变脑膜驯化肿瘤细胞中相应的细胞周期关键因子，然后颈动脉注射到小鼠体内，通过监测小鼠脑膜成瘤情况，进一步验证细胞周期关键因子对亲脑膜性的调控。

图1-3-A3 明确具有调控NSCLC脑膜转移潜能的细胞周期关键因子组成及类别技术路线图

3.2研究细胞周期关键因子调变诱导肿瘤细胞亲脑膜生物学特性及介导脑膜转移潜在机制
3.2.1通过多组学技术描绘NSCLC脑膜转移克隆时空演变全景图，多维度分析细胞周期关键调变因子对肿瘤转移潜能及其亲脑膜的作用。
（1）研究人群入组标准和标本收集：入组NSCLC脑膜转移患者，获取每个患者转移前肺原发肿瘤组织、脑膜转移后肺原发肿瘤组织、脑脊液等配对样本80例，收集正常肺组织10例作为对照。纳入标准：1）年龄≥18岁；2）诊断为NSCLC脑膜转移；3）临床资料和随访资料齐全。
（2）多组学检测：
1）全外显子测序：①样品DNA质控；②将基因组DNA随机打断成长度为180bp-280bp左右的片段；③末端修复反应、3’端加“A”尾；④测序接头与文库连接；⑤文库片段筛选；⑥PCR扩增DNA文库；⑦扩增外显子DNA文库；⑧文库库检和桥式PCR；⑨上机测序。
2）Bulk转录组测序：①提取组织样本的RNA；②反转录为cDNA后进行的新一代高通量测序；③片段的拼接组装；④分析基因表达的全局状况；⑤在转录层面分析基因表达水平的变化；⑥关键信号通路和功能富集。
3）单细胞转录组测序：组织样本100mg/例，脑脊液20ml。①样本解离：制备单细胞悬液；②单细胞分离；③细胞裂解及捕获；④反转录及扩增；⑤建库；⑥测序；⑦生信分析，包括细胞轨迹分析等。
4）单细胞DNA测序(组织)：①样本取材；②引物库设计；③组织细胞核提取及浓度测定；④单细胞文库的制备；⑤上机检测；⑥数据分析：绘制出肿瘤的克隆结构和肿瘤进化图谱。
5）ELISA实验检测黏附分子：①特异性抗原与固相载体联结；②稀释受检脑脊液；③加酶标抗抗体；④加底物显色；⑤上机检测趋化因子和炎性因子水平。
（3）综合分析，描绘NSCLC脑膜转移克隆时空演变全景图，着重分析细胞周期关键调变因子在推动肿瘤异质性、干性分子、上皮间质转化、脑膜潜在特异性黏附分子表达调控以及EGFR-TKI耐药等影响。

图1-3-B1 多组学描绘NSCLC脑膜转移克隆时空演变全景图技术路线图

3.2.2研究细胞周期关键因子调变对肺癌细胞亲脑膜特性的调控环节及机制
明确细胞周期关键因子通过何种机制影响肺癌细胞脑膜转移。首先通过转录组基因测序分析不同细胞株与脑膜转移相关的基因表达差异，再逐一通过Q-PCR及Western blot验证基因表达及相关功能的差异，全面分析生物学特性改变及耐药性。研究的细胞包括上述构建的细胞周期关键因子敲除或过表达的肺癌细胞和配对的野生型细胞、驯化前后的亲代和驯化肺癌细胞。
3.2.2.1分析细胞周期关键因子调变对肺癌细胞迁移及侵袭能力的影响
（1）分析细胞周期关键因子调变对细胞株转移相关分子表达的影响
进一步验证不同肺癌细胞株中转移相关的分子表达变化；其中黏附分子包括整联蛋白、细胞间黏着分子（ICAM-1）、血管细胞黏着分子（VCAM-1）、纤连蛋白（FN）、整联蛋白链接激酶（LIK）、黏着斑激酶（FAK）和凝血酶受体（PAR1）等；趋化因子受体包括与肿瘤转移相关的CXCR2、CXCR4、CCR4、CCR5和CCR7等。根据mRNA检测结果，筛选出差异表达极显著的基因，通过Western blot方法检测差异基因在蛋白水平的变化。
（2）划痕实验和Transwell迁移实验检测不同细胞株的运动及迁移能力。
（3）穿行内管内皮细胞体外模型：在Transwell上层小室接种人内皮细胞（HUEC）,将待观察的肿瘤细胞悬浮于小室中，24小时后计数进入下层小室的肿瘤细胞数量。
（4）细胞运动能力观察模型：利用高内涵成像分析系统，实时动态观察肿瘤细胞的生长及活动轨迹。
（5）体内肾包膜移植瘤模型验证不同细胞株的细胞运动及迁移能力
3.2.2.2 分析细胞周期关键因子调变对肺癌细胞EMT特性的影响
（1）进一步验证细胞周期关键因子调变细胞株EMT相关分子的变化
EMT标志分子：EMT最显著的特征是E-钙黏蛋白（E-Cad）的丢失，和间质表型相关蛋白如N-钙黏蛋白（N-Cad）和波形蛋白的表达升高，另外MMP-2、MMP-9等基质金属蛋白酶也发生变化。
（2)肾包膜移植瘤模型组织原位分析EMT相关蛋白的表达差异
研究方案3.1.2第一部分中构建的肾包膜肿瘤模型，成瘤后取出肿瘤组织，进行石蜡包埋切片，通过组织免疫荧光法检测VIM、E-Cad及N-Cad等EMT标志分子在模型中的变化。
3.2.2.3 分析细胞周期关键因子调变对肺癌细胞干性的影响
（1）进一步验证细胞周期关键因子调变后肺癌细胞干性相关分子的变化
细胞干性相关基因：广谱的肿瘤干性标志物包括CD133、CD44、醛脱氢酶（ALDH）等，肺癌细胞特异性的干性标志物CD24和CD22。
（2）梯度稀释法检测不同细胞株的细胞生长能力差异。
（3）体外球形培养实验观察不同细胞株的成球能力的差异。
3.2.2.4 分析细胞周期关键因子调变对肺癌细胞EGFR-TKI的影响
（1）验证细胞周期关键因子调变后肺癌细胞EGFR基因突变及耐药能力分析
检测的突变基因包括EGFR基因上外显子18、19、20、21上发生的突变（对第一代EGFR-TKI药物-厄洛替尼/吉非替尼敏感）；EGFR的G719X、L861Q和S768I突变位点（对第二代EGFR-TKI药物-阿法替尼敏感）；EGFR的T790M突变位点（对第三代EGFR-TKI药物-奥希替尼敏感）等；分析不同细胞株药物敏感性差异。

（2）分析不同肺癌株（敲除或过表达及其配对的野生型）EGFR-TKI耐药性。

图1-3-B2 研究细胞周期关键因子调变对肺癌细胞亲脑膜特性的调控环节及机制
3.3 探索细胞周期关键分子介导肿瘤免疫逃逸机制
3.3.1应用多组学技术描绘探索细胞周期关键因子调变介导脑膜免疫微环境变化的全景图，探索细胞周期关键因子调变重塑脑膜免疫微环境的可能机制。
（1）研究人群及样本收集：纳入细胞周期关键因子变异的NSCLC脑膜转移患者50例，无细胞周期关键因子变异的NSCLC脑膜转移患者50例（作为阳性对照），获取患者转移前、后肺原发肿瘤组织、脑脊液等配对样本；另外纳入无恶性肿瘤病史的接受腰椎穿刺麻醉“健康人”15例（作为阴性对照）。脑膜转移患者纳入标准：1）年龄≥18岁；2）诊断为NSCLC脑膜转移；3）具有二代测序结果；4）临床资料和随访资料齐全。
（2）单细胞测序：方法同（3.2），检测免疫分子的变化规律。
（3）流式细胞术：①细胞重悬；②一抗孵育；③细胞清洗；④细胞再次重悬；⑤二抗孵育；⑥细胞清洗；⑦上机检测。检测免疫细胞类型改变情况。
（4）进行ELISA实验：方法同3.2
综合分析、揭示NSCLC脑膜转移免疫微环境的变化规律、探索肿瘤细胞的细胞周期关键因子调变介导肿瘤免疫逃逸机制。

图1-3-C1 多组学描绘探索细胞周期关键因子调变介导脑膜免疫微环境变化的全景图技术路线图

3.3.2通过体内外实验分析肿瘤细胞周期关键因子调变介导脑膜转移的免疫逃逸机制

鉴于人的肿瘤细胞株只能接种免疫功能缺失的小鼠品系，无法观察脑膜微环境的变化。本部分拟利用C57BL/6小鼠来源的LLC细胞，通过分析不同细胞株脑膜成瘤率（细胞周期关键因子基因表达差异、脑膜定植驯化及EGFR-TKI诱导耐药），最终确定重点分析的细胞株；通过体内外实验分析肿瘤细胞周期关键因子调变对脑膜免疫微环境的调控。
3.3.2.1 分析细胞周期因子表达水平不同动物模型中脑膜免疫微环境中差异
结合临床患者脑脊液免疫细胞分析的结果，重点观察不同荷瘤模型脑膜免疫微环境中T细胞、NK细胞及髓系来源免疫抑制细胞的差异。首先利用研究方案第一部分中构建的成对细胞株（基因敲除和野生型细胞株；或者耐药株和亲本株），构建原位脑膜转移模型。成瘤3周后处死小鼠，取脑脊液，流式细胞术分析其中免疫细胞的组成，包括T细胞、NK细胞、巨噬细胞、粒细胞以及DC细胞等在脑脊液中所占的比例；分析T细胞的活化或抑制分子标志，包括PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG-3和CD69、CD25、CD62L、CD44等；分析髓性细胞各细胞亚型比例，包括巨噬细胞中的M1和M2，以及抑制性MDSC；另外通过ELISA或CBA法检测脑脊液中炎症相关因子如IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β等，以及趋化因子，包括具有血管生成作用的CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7和CXCL8，具有促进转移作用的CCL19和CXCL12、CXCL13等。同样，对研究方案3.1.3中的脑膜转移驯化模型，以及细胞周期关键因子调变后的驯化模型，进行上述指标的分析。进一步验证细胞周期关键因子对脑膜免疫微环境的调节作用。
3.3.2.2 动态监测亲脑膜转移模型中免疫微环境的变化
根据上面的分析结果，筛选差异显著的免疫学指标，动态监测细胞周期关键因子调变后，免疫微环境（脑脊液免疫细胞及可溶性免疫分子）的实时改变。
3.3.2.3 体外验证细胞周期关键因子对免疫细胞功能的影响
建立体外共培养体系，分析细胞周期关键因子调变后脑膜驯化肺癌细胞对T细胞及髓系来源免疫细胞的影响。
（1）小鼠肺癌细胞与T细胞共培养体系：体外分离小鼠脾脏T细胞，加入辐照APC细胞和不同肺癌细胞株，检测T细胞活化、分化和释放细胞因子的差异。
（2）小鼠肺癌细胞与MDSC细胞共培养体系：分离小鼠骨髓细胞，加入GM-CSF和IL-6诱导分化为MDSC，随后加入不同肺癌细胞株或其培养上清，检测MDSC的分化比例及相应功能分子的变化，同时观察MDSC抑制T细胞功能的差异。
（3）小鼠肺癌细胞与巨噬细胞共培养体系：分离小鼠骨髓细胞，加入MM-CSF其分化为巨噬细胞，随后加入不同肺癌细胞或其培养上清，检测M1、M2细胞比例及巨噬细胞活化、吞噬及释放炎症因子能力的差异。

图1-3-C2 体内外实验分析肿瘤细胞周期关键因子调变介导脑膜转移的免疫逃逸机制技术路线图

3.4 探讨靶向细胞周期关键分子联合免疫治疗NSCLC脑膜转移的协调机制及联合策略
3.4.1开展临床研究进一步验证CDK4/6抑制剂联合免疫治疗或靶向治疗的疗效及安全性，探索细胞周期关键调变分子作为疗效生物标记物的可能性。
3.4.1.1开展CDK4/6抑制剂（达尔西利）联合EGFR-TKI 治疗驱动基因阳性NSCLC脑膜转移继发EGFR-TKI耐药Ib/II期前瞻性单臂临床研究：
（1）样本数：入组驱动基因阳性NSCLC脑膜转移继发EGFR-TKI耐药患者9例（Ib期爬坡）+20例（II期扩展）；
（2）主要入排标准：纳入标准：1）年龄≥18岁；2）ECOG评分：0-2分；3）脑脊液细胞学检查确诊为NSCLC脑膜转移；4）EGFR-TKI治疗继发性耐药。 排除标准：1）非NSCLC来源的脑膜转移; 2）中枢神经系统感染、自身免疫系统疾病、急性脑血管疾病等。
（3）干预处理及研究终点：
①Ib期爬坡：先给予达尔西利（低剂量）+标准剂量EGFR-TKI (n=3)；可耐受再给予达尔西利（中剂量）+标准剂量EGFR-TKI (n=3)；若能继续耐受则再给予达尔西利（高剂量）+标准剂量EGFR-TKI (n=3)。主要研究终点为：安全性。III度以上不良反应作为剂量限制性毒性，确定II期研究的推荐剂量。
②II期扩展：达尔西利(最佳剂量)+ 标准剂量EGFR-TKI (n=20)。

主要终点：客观缓解率（ORR）; 次要终点：无病进展生存期（PFS）、总生存期（OS）、副反应等；探索性目标：细胞周期关键因子是否能作为达尔西利联合靶向治疗疗效的生物标记物。疗效评价：RANO评价系统[1]。

图1-3-D1  达尔西利联合EGFR-TKI 治疗驱动基因阳性NSCLC脑膜转移继发EGFR-TKI耐药Ib期爬坡试验技术路线图

图1-3-D2 达尔西利联合EGFR-TKI 治疗驱动基因阳性NSCLC脑膜转移继发EGFR-TKI耐药II期扩展试验技术路线图

3.4.1.2开展CDK4/6抑制剂（达尔西利）联合免疫抑制剂治疗驱动基因阴性经标准治疗失败的NSCLC脑膜转移Ib/II期前瞻性单臂临床研究：
（1）样本数：入组驱动基因阴性经标准治疗失败的NSCLC脑膜转移患者9例（Ib期爬坡）+20例（II期扩展）；
（2）主要入排标准：纳入标准：1）年龄≥18岁；2）ECOG评分：0-2分； 3）诊断为NSCLC脑膜转移；4）驱动基因阴性；5）经标准治疗后出现进展。排除标准：1）非NSCLC来源的脑膜转移; 2）中枢神经系统感染、自身免疫系统疾病、急性脑血管疾病等。
（3）干预处理及评价终点：
①Ib期爬坡：先给予达尔西利（低剂量）+标准剂量免疫抑制剂(n=3)；可耐受再给予达尔西利（中剂量）+标准剂量免疫抑制剂(n=3)；若能继续耐受则再给予达尔西利（高剂量）+标准剂量免疫抑制剂(n=3)。主要研究终点为：安全性。III度以上不良反应作为剂量限制性毒性，确定II期研究的推荐剂量。
②II期扩展：达尔西利(最佳剂量)+标准剂量免疫抑制剂(n=20)。
主要终点：客观缓解率（ORR）; 次要终点：无病进展生存期（PFS）、总生存期（OS）、副反应等；探索性目标：细胞周期关键因子是否能作为达尔西利联合免疫治疗疗效的生物标记物。
疗效评价：RANO评价系统[1]。

图1-3-D3  达尔西利联合免疫抑制剂治疗驱动基因阴性经标准治疗失败的NSCLC脑膜转移Ib期爬坡试验技术路线图

图1-3-D4  达尔西利联合免疫抑制剂治疗驱动基因阴性经标准治疗失败的NSCLC脑膜转移II期扩展试验技术路线图

3.4.1 探讨细胞周期因子抑制剂联合免疫治疗（或靶向治疗）脑膜转移瘤的方案及协同机制
3.4.1 验证预测脑膜转移或EGFR-TKI耐药的基因标志物
根据3.1.2研究方案中的实验结果以及临床脑膜转移患者基因测序数据分析结果，初步筛选NSCLC发生脑膜转移和EGFR-TKI耐药后肺癌细胞的标志性基因种类，根据研究方案3.3.1部分的免疫微环境的差异，动态监测肺癌细胞的基因改变过程，验证这些改变是否可以作为预测脑膜转移或EGFR-TKI耐药的基因标志物。
3.4.2 明确具有抑制脑膜转移的免疫治疗策略及治疗方案
根据研究方案3.3.1中的研究结果，针对细胞周期关键因子调变后免疫微环境发生的变化，结合临床脑膜转移患者免疫微环境的变化规律；通过原位脑膜肿瘤模型及驯化脑膜转移模型验证免疫治疗效果，摸索免疫治疗的剂量与给药时间，分析免疫治疗的抗肿瘤效果，结合3.3.1中免疫微环境中的变化指标，进一步验证免疫治疗后微环境是否发生逆转。
3.4.3 明确具有抑制脑膜转移的细胞周期因子抑制剂的类别及治疗方案
根据研究方案3.1.2中的研究结果，针对脑膜转移驯化后细胞周期关键因子的改变，设计相应的细胞周期因子抑制剂，明确药物的给药剂量及给药时间节点，通过脑膜转移驯化模型验证相应抑制剂的抗肿瘤效果，并分析给药前后肺癌细胞的生物学特性改变。
3.4.4 探索靶向细胞周期关键因子与免疫治疗药物（或靶向药物）的联合方案及协同机制
根据上面治疗药物的筛选，构建脑膜转移瘤模型，分析细胞周期因子抑制剂能否逆转靶向药物的耐药性，以及细胞周期因子抑制剂与免疫治疗药物联合应用的疗效。同时，比对治疗前后肺癌细胞及免疫微环境进行分析，明确免疫治疗与细胞周期关键因子抑制剂协同作用机制，为临床制定靶向细胞周期关键因子与免疫治疗药物的联合方案提供思路和理论依据。

图1-3-D5 探索细胞周期因子抑制剂联合免疫治疗（或靶向治疗）脑膜转移瘤的方案及协同机制技术路线图

3. 研究基础
3.1 已发表的前期研究工作

（1）前期基础1：开创新治疗方案，延长患者总生存并形成学科特色诊疗

图2-1 培美曲塞鞘注联合多种手段治疗脑膜转移患者的疗效及不同样本基因突变情况

(A)Kaplan-Meier生存曲线显示培美曲塞鞘注联合多种手段治疗脑膜转移患者的中位生存情况；(B)脑脊液样本与颅外样本基因突变谱比较。
（Miao Q et al. Annals of Palliative Medicine. 2020, 9(6): 4233-4245）

课题组以难治性脑膜转移诊疗为特色，每年收治肺癌脑膜转移患者超100例。突破以往治疗常规，采用以培美曲塞鞘注为基础的多种联合手段重拳出击治疗难治性脑膜转移。回顾性分析其中80例患者发现，接受培美曲塞鞘注联合多种手段的患者中位生存期较以往显著延长，达14.1个月（图2-1A）；此外，对患者脑脊液、原发组织和血浆样本进行基因检测发现，大量拷贝数变异在原发组织或血浆中未被发现，而在脑脊液中可检测到（图2-1B），提示脑脊液检测准确度更高，该研究部分数据已经发表在《Annals of Palliative Medicine》杂志上。
（2）前期基础2：揭示细胞周期通路异常是奥希替尼耐药的主要原因之一

课题组长期致力于EGFR-TKI耐药机制研究，前期利用二代测序技术检测分析来自多中心的100例奥希替尼耐药的肺癌组织，发现细胞周期关键基因RB1是第三常见的突变基因，突变率达12%，部分患者还出现CDK13的突变（图2-2A），提示细胞周期通路异常是奥希替尼耐药的主要原因之一。该结果已经发表在《Lung cancer》杂志上。

此外，对57例NSCLC脑膜转移继发TKI耐药患者的脑脊液基因组分析发现，CDKN2A/B、RB1、CCNB1等细胞周期关键基因存在高频突变（图2-2B），进一步提示脑膜转移患者细胞周期通路异常是奥希替尼耐药的主要原因之一。

图2-2 肺癌及肺癌脑转移EGFR-TKI耐药机制研究

(A)5名患者奥希替尼治疗前后体细胞突变谱；(B)57例NSCLC脑膜转移患者基因突变图谱
（Zhao J et al. Lung Cancer. 2020, 141: 114-118）
（3）前期基础3：揭示低剂量铂类化疗药物重塑肿瘤免疫微环境机制

课题组前期揭示低剂量铂类化疗药物即可通过重塑肿瘤微环境而促进T细胞浸润；贯序给予PD-1/PD-L1抗体可显著增强铂类药物疗效，且二者的协同疗效依赖于外周T细胞的再循环（图2-3）。这些工作为本项目确定脑膜转移瘤模型联合治疗方案提供重要的免疫学决策依据和肿瘤微环境分析的技术支撑。研究结果2020年发表《American Jouranl of Cancer Research》杂志后，被Nature Reviews Cancer，Advanced Drug Delivery Reviews等多个权威杂志引用。

图2-3 化疗药物与PD-1/PD-L1抗体联合抗肿瘤机制的研究

(A-B)低剂量奥沙利铂（Oxa）处理后小鼠肿瘤微环境T细胞浸润情况；(C) PD-1抗体不同给药时间点对联合Oxa疗效的影响；(D)T细胞归巢抑制削弱二者的联合抗肿瘤疗效。
(Fu D et al. American Jouranl of Cancer Research. 2020, 10(2):473-490)
 
3.2未发表的前期研究工作
（1）前期基础4：基因组学分析提示细胞周期关键因子调变是肺癌脑膜转移潜在的驱动因子

课题组前期对80例NSCLC脑膜转移及264例无脑膜转移的NSCLC患者进行基因组学分析发现，细胞周期关键基因CDNK2A拷贝数缺失（26% vs 12%）、CDKN2B拷贝数缺失（18% vs 9%）、RB1拷贝数缺失（14% vs 7%）以及CDK4扩增（11% vs 5%）等在脑膜发生率显著高于无脑膜转移患者（图2-4A）。进一步对30例脑膜转移患者配对的脑脊液和外周肺组织（转移前活检）基因组分析显示，细胞周期关键基因在脑脊液中突变率明显升高（图2-4B）。这些结果提示细胞周期关键基因突变可能是NSCLC脑膜转移潜在的关键驱动因子。此外，CDKN2A/B突变的脑膜转移患者中位生存期显著低于无突变患者（7.2月vs 17.2月,图2-4C）。

图2-4 二代测序技术检测脑膜转移基因突变情况

(A)脑膜转移与无脑膜转移NSCLC患者的突变谱；(B)30例配对脑膜转移患者脑脊液和肺原发组织突变谱；(C)生存分析显示CDKN2A/B与脑膜转移患者不良预后显著相关。
（2）前期基础5：单细胞测序数据提示细胞周期关键因子调变是NSCLC脑转移的早期关键事件
随后，课题组对GEO数据库中的NSCLC脑转移单细胞测序数据进行挖掘，根据CNV推断分析发现，细胞周期调控关键分子在NSCLC脑转移瘤中发生高频CNV事件（100%，n=7），并推断出分子的CNV克隆演化进程：4例患者CDKN1A6发生改变且均在早期克隆，其为脑转移主干改变；6个患者CDK4拷贝数发生改变且为伴随改变（图2-5）；提示细胞周期关键分子调变是NSCLC转移的关键事件。

图2-5 基于单细胞测序分析NSCLC脑转移中细胞周期关键分子驱动及伴随调变

(A)克隆演化图；(B) CNV热图（展示关键基因）。
（3）前期基础6：单细胞测序发现脑膜转移患者脑脊液中肿瘤细胞与细胞间黏附分子（ICAM）相互作用更显著 
课题组前期收集NSCLC脑膜转移患者脑脊液及无脑膜转移患者肺原发灶组织，通过单细胞测序发现：原发灶中肿瘤细胞和其他细胞类型之间的黏附因子ICAM通路互作强度较低，提示黏附强度较低；而在脑膜转移患者的脑脊液中，ICAM通路互作强度高，且分布于多种细胞类型之间（图2-6）。该结果提示黏附因子互作可能有利于肿瘤细胞在脑脊液中的定植。

图2-6 NSCLC脑膜转移患者脑脊液肿瘤细胞与ICAM相互作用网络图

左图为无脑膜转移NSCLC患者肺原发灶，右图为脑膜转移患者脑脊液。

（4）前期基础7：单细胞转录组测序初步揭示NSCLC脑膜转移患者与非肿瘤患者的脑膜免疫微环境差异显著
课题组前期通过单细胞转录组测序技术，对本中心的10例肺癌脑膜转移患者及1例非肿瘤脑脊液进行检测，发现NSCLC脑膜转移患者与非肿瘤患者的脑脊液中免疫细胞的组成存在明显差异，NSCLC脑膜转移患者脑脊液免疫细胞组成以单核细胞为主体，占比50%-95%（图2-7 A-E）。此外，脑膜患者治疗后NK细胞消失（图2-7 F-H）。 这些结果初步揭示了NSCLC脑膜转移灶独特的免疫微环境。

图2-7 单细胞测序揭示NSCLC脑膜转移肿瘤微环境。

(A)按细胞类型聚类分析；(B)按样本聚类分析；(C)免疫细胞在各个样本中的所占比例；(D-E)细胞亚群的代表性基因；(F-H)患者治疗前后细胞、样本聚类分析以及免疫细胞所占比例。
 
（5）前期基础8：发现脑转移灶和肺原发灶间肿瘤微环境存在很大的异质性，其中一类巨噬细胞亚群可能为中枢神经系统转移病灶所特有。
前期基于高精度的单细胞转录组分析方法，对GEO数据库中的NSCLC脑转移灶肿瘤微环境单细胞图谱进行鉴定，发现脑转移灶和肺原发灶间肿瘤微环境存在很大的异质性，其中一类巨噬细胞亚群为脑病灶所特有(图2-8 A-E)，并且显著高表达TFF1和TFF3基因(图2-8 F)。

图2-8单细胞测序解析NSCLC脑转移肿瘤微环境。

(A)细胞亚群聚类分析；(B)细胞亚群的代表性基因；(C-E)各类细胞亚群在肺组织、原发灶、远处转移灶及脑转移灶的分布；(F)每一类细胞亚群的差异表达基因情况。
 
（6）前期基础9：临床实践中NSCLC脑膜转移继发EGFR-TKI耐药患者采用CDK4/6抑制剂联合EGFR-TKI、培美曲塞鞘注化疗取得良好效果。即将开展研究者发起的CDK4/6抑制剂联合靶向治疗的I期临床研究。
前期在临床实践中，针对1例EGFR阳性的NSCLC脑及脑膜转移继发EGFR-TKI耐药患者，经一代、二代及三代靶向治疗、标准化疗、免疫治疗等多程治疗病情进展（外周及中枢神经系统病灶均进展），脑脊液基因显示EGFR 19del及CDKN2A基因缺失，采用CDK4/6抑制剂（阿贝西利）联合奥希替尼、培美曲塞鞘注化疗的综合治疗，患者在治疗1月后颅内病灶出现显著缩小（图2-9），这一个案强烈提示CDK4/6抑制剂联合靶向治疗在逆转靶向治疗继发性耐药患者具有进一步探索的前景。同时本课题组已经申请开展CDK4/6抑制剂联合靶向治疗的I期临床研究，医院伦理已通过审核（详见附件4）。这些工作将为本项目靶向细胞周期关键因子联合其他治疗模式的临床研究开展奠定了重要的实践基础。

图2-9 分析不同肺癌细胞株表达细胞周期关键因子的情况及EGFR-TKI突变基因

（7）前期基础10：初步分析不同肺癌细胞株中细胞周期关键因子的表达情况，确定后续待研究的细胞株种类
结合临床研究数据分析结果，课题组利用CCLE（Cancer Cell Line Encyclopedia）肿瘤细胞株数据库初步分析细胞周期关键调控基因在不同肺癌肿瘤细胞株的表达情况，结果显示：CDKN2A、CDKN2B、CDK4、CDK6及RB1在不同肺癌中表达存在较大差异，结合研究院储存的细胞株类型，后续选用人肺癌细胞株（包括A549、HCC827、H1299、NCIH1666、NCIH23及PC9等）及C57BL/6小鼠来源的Lewis肺癌细胞系LLC等（图2-10 A-B）。其中，A549及NCIH1666低表达CDKN2A/2B拟用于构建CDKN2A/2B过表达细胞株，HCC827及PC9细胞CDKN2A/2B高表达拟构建CDKN2A/2B敲除细胞株（图2-10 C-D）。

图2-10 细胞周期关键调控因子在不同肺癌细胞中表达分析