利用患者的免疫系统来对抗癌症的癌症免疫疗法已经彻底改变了癌症治疗策略。然而，很大一部分患者没有表现出临床反应，并且对耐药的潜在机制仍然知之甚少。CD8 T细胞是抗肿瘤免疫反应的关键介质，也是当前免疫治疗方法的主要靶标。与非浸润肿瘤相比，CD8 T细胞的肿瘤浸润与预后改善和对免疫检查点阻断的疗效获益相关[1-2]。然而，这些CD8 T细胞由于其耗竭状态而失去功能，其特征在于抑制分子（包括PD-1，CD38和TOX）的表达以及细胞毒性效应功能的丧失[3-8]。多项研究表明，慢性抗原暴露和T细胞受体（TCR）的刺激是T细胞耗竭程序所必需的[7,9-10]。但这在肿瘤微环境（TME）中是如何发生的还有待研究。
TME的免疫成分在调节有效的抗肿瘤T细胞反应方面发挥着重要作用。在很多实体瘤中，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的丰度与预后不良密切相关，人们越来越注意到巨噬细胞在肿瘤进展和扩散中的免疫抑制作用。课题组前期研究发现，CD8 T细胞优先定位在TME中富含巨噬细胞的区域，说明TAM在调节有效的抗肿瘤T细胞反应中起着重要作用。因此，本文对肿瘤中TAM和CD8 T细胞的相互作用展开研究[11]。
CD8+ T 细胞耗竭与 TME 中巨噬细胞丰度相关
为了研究骨髓免疫细胞如何促进TME中的CD8 T细胞耗竭，研究首先通过在黑色素瘤（B78ChOVA）荷瘤小鼠中进行抗体介导的CSF1-CSF1R信号阻断，来研究肿瘤相关巨噬细胞在CD8+ T细胞耗竭中发挥的作用（图1A）。研究发现，阻断CSF1-CSF1R信号可导致肿瘤中TAMs的比例显著降低（图1B、C）。在不影响浸润T细胞比例的情况下，TAM急性缺失导致了肿瘤浸润性T细胞上耗竭相关的标志物PD-1、CD38和TOX的表达同时降低（图1D），而且CD8+T细胞产生了更高水平的IFN-g、TNF-a（图1E、F）。并且，PD-1、CD38、TOX三者的表达水平与TME中TAMs的丰度呈正相关（图1G）。与之一致，通过流式检测20名肾癌患者的组织样本，发现PD-1和CD38（而不是CTLA-4）的表达与患者的髓系细胞向巨噬细胞分化的程度有很强的相关性（图1H）。
图1
CD8 Tex在TME中长期停留时表达单核细胞/巨噬细胞相关因子
为了研究TAM丰度与CD8 + T细胞耗竭之间的关联，作者从小鼠肿瘤中分离出早期T细胞（Texd4）和晚期耗竭的T细胞（Texd14），通过RNA-seq比较Texd4、Texd14与脾脏初始T细胞的表达谱。结果发现Tex d14细胞的耗竭相关标志物表达显著增强，而初始T细胞中幼稚前体相关基因表达增强（图2A）。通过分析通路富集发现涉及“异常细胞因子分泌和“受损巨噬细胞趋化性”的通路在Tex d14中显著富集（图2B）。进一步分析单个基因，同样发现在Tex中与幼稚前体相关的基因表达减少，与耗竭相关的基因增加（图2C）。作者还发现大量的骨髓相关基因在Tex中高度上调，且随着在TME中的长期驻留而增加，这部分基因多为已知的单核细胞/巨噬细胞调节因子（图2C）。而且在效应T细胞中并没有观察到这些变化，表明CD8 + T细胞独特的耗竭基因表达是由于在TME中长时间驻留而获得的。
接下来，作者使用ATAC-seq进行表观遗传学分析，证实在Tex d14细胞中，编码髓系相关基因的基因转录起始点附近的染色质可及性显著增强（图2D）。其中Tox是T细胞耗竭主要的转录和表观遗传调节因子（图2E）。与初始T细胞相比，Tex中髓系相关基因Csf1、Ccl3、Ccl4和Ccl5的可及性也得到了增强（图2F）。此外，使用患者肿瘤样本进行RNA-seq，同样发现T细胞耗竭分数的增加与T细胞中CSF1、CCL3和CCL5的表达显著相关（图2G）。
图2
TAM独特的TCR结合诱导CD8 T细胞中的耗竭程序
作者进一步研究TAM诱导的“功能失调”的TCR触发情况，作者将先前激活的CD8+T细胞与TAM或cDC1进行体外共培养。共培养3天后，只有遇到表达其同源抗原的CD103+ cDC1的CD8+T细胞显示出高水平的CD44和IRF4表型 （图3A）。在慢性病毒感染中，IRF4被认为是诱导和维持T细胞耗竭的转录回路的主要调节器。研究发现TAMs以抗原特异性方式诱导CD8+T细胞中PD-1和TOX的表达增加（图3A）。
肿瘤内部区域通常处于极度缺氧的环境，为了研究TAM-Tex相互作用的信号是否足以使T细胞耗竭，作者在低氧（1.5% O2）和常氧（21% O2）条件下进行了共培养实验。在低氧条件下，由B16chova衍生的TAM诱导的PD-1+ CD8+ T细胞的比例更高 （图3B和5C）。说明缺氧增强了TAMs诱导T细胞耗竭的能力。使用缺氧示踪剂，作者发现B78ChOVA黑色素瘤显示出高度缺氧的区域，朝着肿瘤的内部区域，远离CD31+血管（图3D）。这些缺氧区域被成片的CD11b+巨噬细胞所包围（图3D）。缺氧相关基因（Car9、Hif1a、Hif2a、Glut1、Vegfa、Vhl）的表达随着耗竭CD8+T细胞中长期驻留而上调（图3E）。表明肿瘤浸润性Tex在TME经历了严重的缺氧。
流式细胞仪分析显示，与耗尽的CD8+T细胞和CD45肿瘤细胞相比，TAM经历了更严重的缺氧水平（图3F和5G）。此外，阻断CSF1R之后，残留的TAMs的缺氧程度显著降低，但Tex的缺氧程度并未降低（图3F和5G）。通过上述研究，作者发现TAMs引起的TCR聚集会诱导CD8+T细胞的耗竭。
图3
总的来说，本研究剖析了耗竭T细胞（Tex）是产生髓系相关因子的主要免疫细胞群，Tex能够积极招募单核细胞并促进其分化成抗原呈递态的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。但TAMs并非盟友，而意在趁人之危，加剧T细胞耗竭。TAMs利用抗原呈递，与CD8+ T细胞之间形成了一种独特且持久的“抗原特异性突触”作用，这种相互作用非但不能激活T细胞活性，反而会诱导T细胞耗竭。治疗策略可以与现有的免疫疗法结合使用，以增强抗肿瘤免疫力，从而扩大从免疫疗法中受益的癌症患者的比例。
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