嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是治疗对标准疗法无效的特定高危血液恶性肿瘤的有效方法。可以观察到接受CAR-T细胞治疗的复发和/或难治性（R/R）B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者、R/R B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）患者和R/R多发性骨髓瘤（MM）患者的完全缓解（CR）率分别为83%、54%和33%。然而，CAR-T细胞疗法产生的有效全身免疫激活也会驱动危及生命的细胞因子释放综合征（CRS）。CRS是CAR-T细胞疗法最常见的副作用，在大多数接受靶向CD19、B细胞成熟抗原（BCMA）、CD20、CD22、CD7、CD123和其他T细胞结合疗法的CAR-T细胞治疗的患者中均可发生。
CRS表现出全身症状，如发热、疲劳和厌食，但可以迅速发展为低血压、呼吸衰竭、休克和器官功能障碍。根据产品和患者的特定因素，高级别CRS（等级≥3）的发生率可高达46%。通过早期和积极的治疗，即使严重的CRS也是可逆的，且CRS的预防不会降低CAR-T细胞功能。因此，如何在早期预测重度CRS的发生是至关重要的。在超生理炎症状态下，CRS与多种趋化因子和炎症细胞因子有关，如白细胞介素（IL）6、IL4、干扰素（IFN）γ和肿瘤坏死因子（TNF）α。
来自浙江大学医学院附属第一医院的黄河教授团队于British Journal of Haematology发表相关研究结果，研究人员收集了214例接受CAR-T细胞治疗的血液系统恶性肿瘤患者的临床数据，并通过测量45种不同细胞因子的水平，开发和验证了预测早期重度CRS的列线图（nomogram）。
研究方法
这项回顾性多中心模型研究在中国杭州（浙江省）、上海、天津、沈阳（辽宁省）和徐州（江苏省）的6家接受CAR-T细胞治疗的血液系统恶性肿瘤患者指定医院进行。
在2018年7月1日至2021年12月31日期间，浙江大学医学院第一附属医院接受BCMA CAR-T细胞疗法的87例MM患者被纳入为训练队列。图1显示了该训练队列的患者招募路径。外部验证队列（MM）由6家医院的6个临床试验（NCT03093168、NCT05066646、NCT05478343、NCT04706936、NCT05430945和ChiCTR-OIC-17011271）中的59例患者组成。在来自浙江大学医学院附属第一医院的5项临床试验（ChiCTR-ORN-16008948、ChiCTR1800015575、NCT03118180、NCT04213469和NCT04532268）中，共有39例ALL患者和29例NHL患者被纳入为另外一个外部验证队列（NHL/ALL）。
图1. 本研究的患者招募流程；LASSO——最小绝对收缩率和选择运算符
研究结果
CRS的临床特征和相应的血清细胞因子谱
表1总结了基线患者特征。训练队列（MM）、外部验证队列（MM）、外部验证队列（NHL/ALL）中重度CRS的发生率分别为47.1%、14.5%、32.4%。重度CRS发生率的差异是由于不同的产品特性和不同的原发病特性，这也增加了预测重度CRS发生的难度。外部验证队列（NHL/ALL）的患者中位年龄低于其他两个队列（P<0.001）。在外部验证队列（NHL/ALL）中观察到较低的肌酐负荷（P=0.038），这是因为MM多发于老年患者，常伴有肾功能不全。其他变量在三个队列中无显著差异。
表1. CRS相关的临床特征
23种细胞因子的血清浓度在 CRSp 期达到峰值，包括CD40L、CX3CL1、CXCL10、Flt3L、GZMB、IFNγ、IL1ra、IL1β、IL3、IL6、IL8、IL10、IL12、IL33、MCP1、MIP1α、MIP1β、MIP3α、MIP3β、PDL1、TNFα、VEGF和G-CSF。然而，CRSp期15种细胞因子的血清浓度低于输注早期或基线时的浓度，包括碱性FGF、CCL5、CCL11、EGF、IFNβ、IL1α、IL2、IL4、IL7、IL13、IL17A、IL17E、PDGFAA、PDGFAB和TRAIL。
列线图开发
训练队列的单变量logistic回归分析的结果确定了与重度CRS相关的18个潜在细胞因子，包括基线Hb和17种细胞因子。将这18个细胞因子纳入LASSO回归模型中，最合适的调节参数λ设置为0.019，使均方误差最小。随后，研究人员确定了LASSO回归模型中具有非零系数的7个潜在细胞因子：MIP1α、CX3CL1、Flt3L、GZMB、IL4、IL6和PDGFAA。研究人员再对这7个潜在细胞因子应用逐步多元logistic回归模型，并排除MIP1α和Flt3L（因为它们的AIC值最小）。因此，最终模型包含5个细胞因子（CAR-T细胞输注后第1-2天的CX3CL1、GZMB、IL4、IL6和 PDGFAA）。
基于最终的多变量模型，通过为与重度CRS相关的每个因素分配加权评分来生成列线图（图2）。评分=2.75*log10（CX3CL1）+2.11*log10（GZMB）+1.69*log10（IL6）-3.52*log10（IL4）-2.11*log10（PDGFAA）-6.77。如果得分为正，则重度CRS的发生概率大于0.5，并且如果得分为负，则重度CRS的发生概率小于0.5。评分代表对数比值，重度CRS发生概率计算如下：exp（分数）/（exp（分数）+1）。模型在训练队列（MM）、外部验证队列（MM）和外部验证队列（NHL+ALL）中的灵敏度分别为78%、80%和100%。
图2. 预测血液恶性肿瘤患者中CAR-T细胞输注后重度CRS发生率的列线图
列线图验证
使用AUC、校准和DCA对列线图进行内部和外部验证。在训练队列中，使用bootstrap验证生成的偏倚校正AUC为0.876（95%CI，0.871-0.882），并且高于EASIX评分（AUC=0.687；95%CI，0.676-0.698）和CX3CL1（AUC=0.710；95%CI，0.702-0.719）、GZMB（AUC=0.636；95%CI，0.625-0.648）、IL4（AUC=0.662；95%CI，0.655-0.670）、IL6（AUC=0.611；95%CI，0.601-0.620）和PDGFAA（AUC=0.601；95%CI，0.590-0.601）的AUC，所有P值<0.0001（表2）。
表2. 训练和外部验证队列中列线图和模型变量的AUC
此外，AUC在外部验证队列（MM，AUC=0.907；95%CI，0.899-0.916）和外部验证队列（ALL/NHL，AUC=0.908；95%CI，0.903-0.913）中保持稳定，显示列线图的优异的鉴别能力。校准图（表观和偏倚校正）与训练和独立外部验证队列中的理想线重叠，表明预测列线图列线图与实际观察结果之间存在充分一致性（图3）。 
图3.重度CRS预测列线图的校准曲线
DCA的结果揭示了在临床实践中应用列线图对于广泛的阈值概率的益处。在训练队列（MM）、外部验证队列（MM）和外部验证队列（ALL/NHL）中，与应用列线图预测重度CRS 发生概率相关的标准化净获益阈值概率范围分别为0.15-1、0.08-0.78和0-0.9。
讨论
已有一些关于CD19 CAR-T细胞治疗的预测模型的报道。既往研究评估了内皮激活和压力指数（EASIX=LDH*肌酐/血小板）作为CD19 CAR-T细胞治疗患者的重度CRS和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）的预后标志物，AUC约为0.8。但在本研究队列中，EASIX评分的AUC仅约为0.7。此外，Teachey等人报道了他们的模型，包括三种细胞因子（CAR-T细胞输注后3天内的IFNγ、IL13和MIP1α），可以准确预测哪些患者会发生重度CRS（≥4级），尤其是儿童患者（他们的模型已在12例儿童患者的独立队列中进行了验证）。另一项研究开发了一种分类树模型，包括早期高热（>38.9°C）和CAR-T细胞输注后前36小时内的血清MCP1浓度，用于早期识别具有≥4级CRS高风险的患者。接受CAR-T细胞治疗的患者中CRS的发生率取决于所使用的CAR-T细胞产品和患者的疾病特征。
迄今为止，全球已注册了2000多项CAR-T细胞治疗相关临床试验，包括靶向CD19、BCMA、CD20、CD22、CD7、CD123和CD19/CD22等的CAR-T细胞治疗。但上述模型是基于CD19 CAR-T细胞产物开发和验证的，不涉及其他靶标。在这项研究中，研究者希望为接受CAR-T细胞治疗的血液系统恶性肿瘤患者建立一个适用于不同CAR-T细胞产品的模型，且可以准确预测早期重度CRS的发生。由于CRS的自然特征是显著的全身性炎症和炎症细胞因子水平的升高，血清细胞因子水平是预测严重CRS的合理生物标志物。因此，研究人员在CAR-T细胞输注后第1-2天检测了外周血中45种独特细胞因子的水平，并将其与患者的基线特征相结合，以在214例血液恶性肿瘤患者中开发和验证模型。
在本研究中，最终模型由5个细胞因子组成，包括IL6、IL4、CX3CL1、GZMB和PDGFAA。IL6被认为是CRS的关键介质（临床采用IL6受体抑制剂托珠单抗治疗CRS）。在识别肿瘤抗原后，CAR-T细胞释放大量穿孔素/颗粒酶用于肿瘤热解。GZMB可以通过穿孔蛋白形成的孔直接进入肿瘤细胞，并裂解与CRS严重程度相关的gasdermin E。同时，尚未报道CX3CL1在CAR-T细胞治疗中的作用。MM细胞不表达CXC3L1，但内皮细胞通过TNFα表达上调CXC3L1的产生。越来越多的证据表明内皮细胞的病变与CRS有关。本研究结果显示CRS严重程度与IL6、GZMB和CX3CL1表达呈正相关，这些表达在CAR-T细胞输注后上调。尽管尚未报道PDGFAA在CAR-T细胞疗法中的功能，但一项研究表明COVID-19中PDGFAA的表达与CRS之间存在关联。有趣的是，研究人员发现CAR-T细胞输注后第1-2天IL4和PDGFAA的血清浓度与CRS等级呈负相关，并且高于CRS峰值。作为CAR-T细胞治疗中的免疫抑制细胞因子，较高血清浓度的IL4可能抑制CAR-T细胞的扩增，导致较低级别的CRS。
总结
CAR-T细胞疗法在血液恶性肿瘤患者中的成功，导致了管理与该疗法相关的新型毒性的需求迅速增加。CRS是CAR-T细胞治疗最常见的并发症，重度CRS可能导致危重疾病和患者死亡。因此，重度CRS的早期预测可以帮助临床医生适当地分配重症护理资源，以在患者出现危重病症之前扭转局面。
总而言之，在这项研究中，黄河教授团队开发并验证了一种用于预测早期接受CAR-T细胞治疗的血液恶性肿瘤患者的重度CRS的列线图。基于CAR-T细胞输注后第1~2天的CX3CL1、GZMB、IL4、IL6和PDGFAA的列线图在预测重度CRS的发生方面具有极好的鉴别能力。
Zhou L, Fu W, Wu S, Xu K, Qiu L, Xu Y, Yan X, Zhang Q, Zhang M, Wang L, et al. Derivation and validation of a novel score for early prediction of severe CRS after CAR-T therapy in haematological malignancy patients: A multi-centre study. Br J Haematol. 2023.
排版编辑：Luna
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