多年来，以氟达拉滨-环磷酰胺-利妥昔单抗（FCR）为代表的化疗免疫治疗是有症状的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者一线治疗的金标准。近年来，靶向治疗彻底改变了CLL患者的预后。微小残留病灶阴性（uMRD）是无进展生存期（PFS）和生存期（OS）的独立预测指标，然而，目前尚无生物标志物可以预测骨髓（BM）uMRD且达到完全缓解（CR）患者的预后。研究发现MicroRNAs是一类在CLL患者中表达发生改变的分子生物标志物，因此本文通过介绍一项对miRNA表达谱进行分层聚类的研究，旨在识别血液中预测CLL患者治疗结局的的miRNAs，从而提供一种新的预测预后工具。
研究背景
CLL是西方最常见的成人白血病，患者中位年龄65岁，50岁以下患者仅占10-15%。新药时代以前，CLL的治疗方案以苯丁酸氮芥（Clb）、氟达拉滨等化疗药物为主，效果并不理想。随着利妥昔单抗的加入，患者疗效进一步得到改善，FCR方案成为CLL患者的治疗曙光。免疫化疗会诱发严重的血液学和感染等不良事件，但其治疗目标是疾病达到CR和uMRD。在过去的十年中，小分子抑制剂如BTKi、PI3Ki及BCL-2i彻底改变了CLL患者的治疗选择，成为高危患者的一线治疗。然而，BTK抑制剂大多使疾病达到部分缓解（PR），因此需要长期持续治疗，以实现疾病持久控制。尽管CLL通常被认为是惰性恶性肿瘤，但其表现出广泛的临床异质性，多数患者临床表现呈现侵袭性，并容易发生治疗耐药或复发。尽管在从化疗转向无化疗方案方面取得了巨大进展，但预测治疗结局的有力工具仍然缺乏，无法最佳地指导治疗决策。
CLL患者预后因素包括临床状况、年龄等，其中IGHV未突变及遗传学异常如17p缺失或TP53突变与预后不良显著相关。治疗后实现uMRD与较好的PFS和OS相关。MRD状态是治疗后最佳预后因素，目前已成为免疫化疗的目标。虽然一般认为BM uMRD对预后预测更为敏感，但临床医生通常选择外周血进行检测。然而，不同治疗方案获得BM uMRD的比例有所不同，FCR方案的uMRD可达44%，而Clb联合奥妥珠单抗（obinutuzumab）方案的uMRD比例较低（19.5%）。
MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA，在转录后水平上调控基因的表达。一些研究将miRNAs与CLL患者的临床特征或预后相关联，从而确定预后最差的CLL亚组人群。对氟达拉滨难治的患者miR-21、miR-148a和miR-222的表达水平显著高于对氟达拉滨敏感患者。此外，在氟达拉滨敏感患者中发现TP53基因激活，提示在无应答患者中，异常miRNA表达与TP53功能失调通路之间可能存在联系。多项研究发现血清和其他体液中miRNAs水平升高，提示miRNAs可在循环中被检测并作为诊断或预后的生物标志物。然而，目前尚未提出基于miRNAs预测治疗结局的模型。因此，本文研究旨在评估初治CLL患者miRNA外周血转录谱，以识别可以预测FCR免疫化疗3个月后达到BM uMRD的miRNA。
研究方法
该研究共纳入前瞻性、随机、开放标签的II期研究（CLL2010FMP，NCT 01370772）中140例初治CLL患者（18-65岁），随机分配到FCR或在Dense-FCR（标准FCR治疗前强化利妥昔单抗治疗（总剂量6500mg））。uMRD定义水平是每10000个白细胞中检测到的CLL细胞数量小于1个（＜10-4）。采用TaqMan低密度阵列（TLDA）技术对16例患者进行miRNA表达分析，并根据治疗反应结果分为两组：1组8例CR且BM uMRD患者；另一组为8例未达到CR（no-CR）和MRD阳性的患者。采用多重Taqman microRNA检测技术对100例初治患者的miRNA表达水平进行定量验证。采用RNA-seq进行高通量分析差异表达基因谱。
研究结果
患者临床特征
在CLL2010FMP研究中招募的140例患者中，只有123例患者的治疗前血液样本可用于RNA分析。患者的特征见表1。中位年龄为58.5岁，26.8%为女性，74%为BinetA期或B期。细胞遗传学分析发现del（13q）、del（11q）和12号染色体三体分别占56、20和11%。治疗前中位淋巴细胞计数为71 G/L。FCR治疗9个月后，65例患者（52.85%）达到完全缓解（CR），53例患者（43.09%）no-CR。不同治疗组之间的CR与no-CR没有统计学差异。在108例血液样本中，69例（63.89%）未检测到MRD，两个治疗组中分布相似（FCR组35例，Dense-FCR组34例）。在95例骨髓样本中，40例（42.11%）BM检测不到MRD，两组之间同样分布相似（FCR组21例，Dense-FCR组19例）。联合CR和BM uMRD，107例患者中有27例（25.23%）对治疗有反应，FCR组和Dense-FCR组分别为24.53%和25.93%。80例患者（74.77%）对治疗无反应，平均分布在FCR组和Dense-FCR组（分别为64.52%和65.57%）。整个队列的总有效率为94%，其中包括53%的CR或Cri。单因素分析显示年龄、Binet分期、β2-微球蛋白或接受治疗周期数，CR率存在显著差异（p=0.026，p<0.0001，p=0.003和p<0.001）。仅有D0时的淋巴细胞计数与BM uMRD率显著相关（p=0.020）。BinetAB期、12号染色体三体、D0时淋巴细胞计数低、完成6个周期治疗的患者更有可能达到CR且PB和BM uMRD（p=0.006，p=0.026，p=0.004，p=0.038）。
表1 患者临床特征
识别与CR伴BM uMRD患者相关的miRNAs
为了基于血液的miRNA特征识别可以预测治疗反应的CLL患者，该研究首先使用基于实时PCR的高通量miRNA微阵列方法，比较了8例CR且BM uMRD和8例no-CR且MRD阳性患者的miRNA表达谱。火山图显示两组间384个差异表达的miRNA，共有46个miRNAs发生显著差异表达，其中3个miRNAs表达上调，43个miRNAs表达下调（图1A）。在这46个显著失调的miRNAs中，只有25个符合可接受的检测极限（Ct值<30个周期），在CR患者中持续观察到过度表达（92%的miRNAs）。与其他患者相比，在患有BM uMRD的CR患者中持续观察到过度表达（92%的miRNAs）（表2）。为了通过RT-qPCR验证miRNA谱，该研究从25个miRNA中挑选出11个显著失调的miRNAs其参与B细胞发生发展的功能和发育（图1B）。
图1 初治CLL患者中，与CR相关的miRNAs和与CR且BM uMRD相关miRNAs（A）；(B) 验证队列中（n=100）RT-qPCR检测11个miRNAs的表达水平
表2 一线治疗中有反应的BM uMRD患者与无反应患者的miRNAs基因表达失调列表
血液miRNAs可预测治疗结局
对这11个miRNAs进行单因素分析显示，免疫化疗前4个miRNAs（miR-15b、-324-3p、-532-3p和-652）过表达与CLL患者的临床反应（CR vs no-CR）相关（表3）。只有miR-125b可以显著预测血液uMRD（p=0.029）。7个miRNAs可预测BM uMRD，8个miRNAs与CR和BM uMRD显著相关。在预后良好的患者中，miRNA表达水平始终高于预后不良的患者（CR vs无-CR患者、血液uMRD vs MRD阳性患者、BM uMRD vs MRD阳性患者、CR伴BM uMRD vs其他患者）。多因素分析显示，BinetAB期（p=0.011）和miR-15b表达升高（p=0.003）与BM uMRD达到CR显著相关。
表3根据CLL患者治疗反应进行单因素miRNA分析
采用治疗前的miRNA表达水平和临床参数，该研究构建了一个决策树，通过采血来预测在FCR治疗后3个月达到BM uMRD且CR的概率（图2）。通过在初诊时采用miR-125b的表达水平作为决策树顶部的根节点，构建受试者工作特征（ROC）曲线，确定能够预测BM uMRD伴CR的阈值。用于构建决策树的ROC曲线的所有参数详见表4。由此产生的阈值用于区分miR-125b高表达和低表达的患者。对每组患者（高与低miRNA表达）进行单因素统计分析。根据2到3个miRNAs表达水平定义6组患者，BM uMRD患者发生CR的比例从72%（miR-125b高、miR-15b高和miR-181c高）到4%（miR-125b低和miR-193b低）。
图2 基线时采用5个血液miRNAs的表达构建决策树模型对CLL患者进行分类并预测治疗结局
表4 5个miRNAs的生物标志物潜力
miRNAs决策树模型预测PFS
中位随访42.4个月，未达到中位PFS和中位EFS，PFS为71%（图3）。基线特征及治疗前检测的miRNA表达水平与PFS之间的单变量相关性见表5。该研究结合基线特征和决策树的5个miRNAs进行多因素分析显示，IGHV-未突变（p=0.041）和淋巴细胞计数>71G/L（p=0.018）与PFS缩短显著相关。根据决策树分组的不同，PFS存在显著差异（p=0.019）（图2）。随访期间，miR-125b高、miR-15b高和miR-181c高（HHH组）均未复发。相比之下，miR-125b高、miR-15b低和miR-412高患者（HLH组）、miR-125b低和miR-193b低表达水平患者（LL组）更易复发，42.4个月PFS分别为71%和52%。其他四组：miR-125b高、miR-15b高和miR- 181c低患者（HHL组）、miR-125b高、miR-15b低和miR-412低患者（HLL组）、miR-125b低和miR-193b高患者（LH组）、42.4个月PFS分别为72%、90%和87%。将这三组患者结合起来可将患者分为不同危险分层从而预测PFS（图3C）。
图3 根据5个miRNA决策树特征预测总患者的PFS。
表5根据基线特征和miRNAs进行PFS单因素分析
HLH组和LL组高危患者中与基因组不稳定性和mRNA代谢相关基因显著富集
为了进一步研究其分子机制，该研究对治疗前对血液样本进行RNA测序，并比较了高危患者（分为HLH和LL组）和无复发特征的HHH组之间的基因表达谱（图4）。结果显示两组患者中鉴定出1373个差异表达基因（DEG），其中67个基因在HLH和LL组样本中过表达，1309个基因在HHH组中过表达（图4A）。基因集富集分析（GSEA）分析显示HLH和LL组中高危患者显著富集的基因与基因组不稳定和mRNA代谢相关，而HHH组主要与免疫应答相关基因、微环境、TP53/RB1靶基因及PRC2靶基因下调相关。
图3 根据5个miRNA决策树特征定义的3个预后组的基因表达谱
研究结论
综上，本文研究通过构建5个miRNA决策树预测患者治疗疗效，结果表明血液miRNAs是FCR治疗疗效的有效预测生物标志物，为CLL患者治疗未满足的需求提供了新的预测工具。
Duroux-Richard I, Gagez AL, Alaterre E, et al. miRNA profile at diagnosis predicts treatment outcome in patients with B-chronic lymphocytic leukemia: A FILO study. Front Immunol. 2022 Oct 17;13:983771. doi: 10.3389/fimmu.2022.983771.
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