肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第四大原因，是一种免疫治疗耐药的恶性肿瘤，具有高度的细胞异质性。HCC手术切除后复发率仍然很高，不可切除的HCC患者预后较差，治疗方式也有限[1]。HCC肿瘤微环境（TME）的一个显著特征是存在大量的癌症相关成纤维细胞（CAFs），这类细胞可以分泌多种细胞因子、趋化因子和生长因子，直接或间接地促进肿瘤的生长[2]。
该研究对人或鼠HCC肿瘤进行scRNA-seq测序，鉴定出HCC肿瘤中存在5种CAF亚型，分别为vCAFs（vascular CAFs，血管型CAF）、mCAFs（matrix CAFs，基质型CAF）、lpmCAFs(lipid processing (lp)-mCAFs，脂质加工基质型CAF或CD36+CAFs)、lpCAFs（lipid processing CAFs，脂质加工型CAF）和apCAFs（antigen-presenting CAFs，抗原提呈型CAF）。本文重点介绍了新发现的CD36+CAF亚群。研究发现巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）在CD36+CAFs中表达，CD36+CAFs以MIF和CD74依赖的方式招募CD33+MDSCs。此外，CD36+CAFs增强了MDSC免疫抑制TME和癌症干细胞的能力。CD36+CAFs的数量可以预测HCC的免疫治疗反应，利用SSO靶向CD36可以协同提高不同小鼠HCC模型的免疫治疗效果。
该研究结果提供了一个全面的转录组学概述，并揭示了CD36+CAFs、CD33+MDSCs和HCC细胞之间新的联系，提示潜在的免疫微环境靶向联合治疗HCC[3]。
scRNA-seq揭示人类HCC肿瘤的复杂性
为了全面表征人类HCC中存在的细胞群，该研究采用scRNA-seq方法对原发肿瘤中的大量细胞进行转录表征。利用已知的标记基因，将HCC细胞划分为9种不同的细胞类型（表1）。
表1：HCC中的9种细胞类型
人类HCC中5种CAF亚型的鉴定和分子特征
使用多重荧光免疫组化技术(mIHC)证实了人类和小鼠中HCC样本中主要CAF亚群的存在。使用α-SMA、CD36、LUM、MYH11和HLA-DRA标记物对人HCC组织进行mIHC染色，证明人HCC组织中存在CAF亚型（图1A）；使用Myh11、Lum、Acta2、CD36和H2-Aa对小鼠HCC组织进行mIHC染色，证明主要CAF簇也存在于小鼠HCC组织中（图1B）。
图1. mIHC证实人和小鼠中存在CAF亚型
mIHC进一步分析发现在人和小鼠HCC肿瘤中，CD36+CAFs在肿瘤核心区域的富集程度高于肿瘤周围区域（图2）。
图2. CD36+CAFs在肿瘤核心区域富集
不同CAF亚群的细胞状态转变轨迹
为了了解CAF亚型之间细胞状态的潜在进化轨迹，该研究基于Monocle 2算法推导了各种CAF亚型的伪时间细胞轨迹。通过结合聚类和伪时间分析的结果，该研究观察到以CAF转分化为特征的mCAFs位于祖细胞状态，lpmCAFs (CD36+CAFs)处于中间状态，最终分化为vCAFs、lpCAFs和apCAFs。分析结果表明CAF细胞最终会向包括血管平滑肌收缩、脂质代谢和抗原提呈在内的终末效应状态动态过渡。
CD36+CAF与MDSCs呈正相关
免疫组化实验表明CD36的表达主要位于HCC间质区，占HCC中CAF群体的35%，表明CD36+CAFs在HCC进展中起关键作用。进一步的mIHC实验表明，与小鼠和人的邻近肝组织相比，CD36+CAFs在肿瘤组织中特异性浸润（图3A）。生存分析显示，CD36+CAFs数量多可以提示HCC患者预后差（图3B）。
图3. HCC中CD36+CAFs浸润高提示患者预后差
进一步研究了CD36+CAFs与TME内的效应T细胞和MDSCs之间是否存在相关性。scRNA-seq数据和TCGA数据显示CD36+CAFs和MDSCs之间呈正相关，但与观察到的效应T细胞(GZMB+CD8+)呈负相关（图3C）。mIHC染色结果显示CD36+CAFs比CD36-CAFs更接近MDSCs（图4）。
图4. HCC中CD36+CAFs与MDSC细胞接近
CD36+CAFs中MIF高表达
为了检测不同CAF产生的MIF水平，通过FACS分离不同CAF亚型。进一步的qPCR和ELISA实验表明，来自CD36+CAFs的MIF表达明显高于来自vCAFs、mCAFs、apCAFs中MIF的表达。
OxLDL通过CD36和脂质过氧化促进p38活化，进而促进MIF的分泌。另外，染色质免疫共沉淀(ChIP)实验发现CEBPA和CEBPD都可以直接结合到MIF的启动子上。这些结果表明CD36介导OxLDL摄取，通过脂质过氧化/p38/CEBP轴促进MIF表达。另一方面CD36+CAF衍生的MIF继续通过IL-6/STAT3激活增强CD33+MDSCs的积累，进而促进免疫抑制性TME和肿瘤干细胞的能力[4]。
响应新辅助免疫治疗患者中低浸润CD36+CAF
作者进一步研究了CD36+CAF在接受新辅助抗PD-1治疗(托利哌单抗联合Lenvatinib作为可切除肝细胞癌的新辅助治疗)的患者切除的HCC组织中的作用（临床试验号:NCT03867370）。结果显示，CD36和α-SMA共表达在抗PD-1反应组中低于无反应组（图5），这表明低数量的CD36+CAF预示着更好的HCC免疫治疗反应。
图5. 响应新辅助抗PD-1治疗患者中低浸润CD36+CAF
总之，该研究结果在单细胞水平上提供了一个全面的HCC转录组学景观，确定了HCC组织中含有5种CAF亚群，即vCAFs、mCAFs、lpmCAFs、lpCAFs和apCAFs，揭示了TME中免疫抑制的一种新模式，为进一步探索脂质氧化和癌症免疫治疗之间的联系打开了一个新方向，并确定了由脂质过氧化诱导的CD36+CAF分泌的MIF调节肿瘤细胞免疫逃避的新机制。进一步研究证实，用SSO靶向TME中的CD36可有效提高免疫治疗的疗效。需要进一步的研究来确定诱导不同CAF亚型形成和激活的肿瘤内信号，并确定其他CAF亚型在TME和肿瘤免疫治疗中的作用。
1. Gordan, J. D., Kennedy, E. B., Abou-Alfa, G. K., Beg, M. S., Brower, S. T., Gade, T. P., Goff, L., Gupta, S., Guy, J., Harris, W. P., Iyer, R., Jaiyesimi, I., Jhawer, M., Karippot, A., Kaseb, A. O., Kelley, R. K., Knox, J. J., Kortmansky, J., Leaf, A., Remak, W. M., … Rose, M. G. (2020). Systemic therapy for advanced hepatocellular carcinoma: ASCO Guideline. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 38(36), 4317–4345.
2. Yin, Z., Dong, C., Jiang, K., Xu, Z., Li, R., Guo, K., Shao, S., & Wang, L. (2019). Heterogeneity of cancer-associated fibroblasts and roles in the progression, prognosis, and therapy of hepatocellular carcinoma. Journal of hematology & oncology, 12(1), 101.
3. Zhu, G. Q., Tang, Z., Huang, R., Qu, W. F., Fang, Y., Yang, R., Tao, C. Y., Gao, J., Wu, X. L., Sun, H. X., Zhou, Y. F., Song, S. S., Ding, Z. B., Dai, Z., Zhou, J., Ye, D., Wu, D. J., Liu, W. R., Fan, J., & Shi, Y. H. (2023). CD36+ cancer-associated fibroblasts provide immunosuppressive microenvironment for hepatocellular carcinoma via secretion of macrophage migration inhibitory factor. Cell discovery, 9(1), 25.
4. Simpson, K. D., Templeton, D. J., & Cross, J. V. (2012). Macrophage migration inhibitory factor promotes tumor growth and metastasis by inducing myeloid-derived suppressor cells in the tumor microenvironment. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950), 189(12), 5533–5540.
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