中心体扩增（CA）是癌症的标志，与高侵袭性疾病和较差的临床结局密切相关。聚集的额外中心体是CA癌细胞有丝分裂所需的主要应对机制，否则会发生有丝分裂失败和细胞死亡。然而，其潜在的分子机制尚未完全阐明。此外，目前对于CA细胞侵袭的过程和相关影响因素方面的信息知之甚少。
Cell Death & Differentiation (IF=12.067) 期刊近期发表的一项研究探索了转化酸性卷曲螺旋蛋白3（TACC3）在伴有CA的高侵袭性乳腺癌中的作用，其研究表明TACC3是伴有CA的高侵袭性乳腺肿瘤的多功能驱动因子，靶向TACC3或是治疗这种疾病的一种有前景的方法[1]。
CA在癌症中普遍存在，并且与多种癌症的肿瘤进展和预后密切相关。在有丝分裂过程中，将额外的中心体聚集到相反的纺锤体两极对于阻止CA癌细胞的多极分裂和凋亡至关重要。TACC3在实体瘤中表达上调，并与几种不同癌症（如乳腺癌[2]、肺癌[3]和卵巢癌[4]）的预后不良密切相关。它局限于中心体以及微管，控制纺锤体的稳定性和微管的新生[5,6]。
尽管越来越多的证据显示TACC3在癌症中具有很强的预后价值，并且靶向TACC3在抑制肿瘤生长方面具有一定的治疗潜力，但目前对于由TACC3驱动的肿瘤生长分子机制知之甚少。此外，目前尚未确定TACC3抑制是否是一种针对伴有CA的高侵袭性肿瘤的有效策略。本研究旨在探索TACC3在伴有CA的高侵袭性乳腺癌中的作用和相关机制。
方法
细胞培养和试剂
人乳腺癌细胞系（ZR-75-1、MDA-MB-231、MDA-MB-157、MDAMB-436、MDA-MB-468、CAL51、HCC1954、JIMT-1、MCF-7、T47D、SK-BR-3、BT-474和HCC1143）以及正常乳腺细胞MCF12A均来自ATCC（即American Type Culture Collection，是目前世界上最大的生物资源中心）。所有细胞均在DMEM（一种广泛使用的基础培养基）中培养，并添加50 U/ml青霉素/链霉素、1%非必需氨基酸和10%胎牛血清。使用MycoAlert支原体检测试剂盒（Sigma，MA，USA）定期鉴定和测试细胞系的支原体污染。
乳腺癌肿瘤样本
为了分析乳腺肿瘤中TACC3蛋白与CA的关联，研究人员从TissueArray, LLC购买了乳腺癌组织芯片（BR1902）。为了分析TACC3蛋白表达与三阴性乳腺癌（TNBC）患者的临床结局之间的关联性，本研究于2000年至2016年间对来自于土耳其安卡拉哈斯特帕大学医学院的78名诊断为TNBC的患者的原发肿瘤样本进行了TACC3免疫组织化学染色（IHC）。
CRISPR/Cas9介导的基因敲除研究
靶向JIMT-1、MDA-MB-231和MDAMB-468细胞中的TACC3的sgRNA序列为5’-CAGGCAACGTACCCTCAGCG-3’和5’-GACTTGGTGTCACCTCCGAA-3’。基于高靶向性（高效性）和低脱靶效应（高特异性）的原则，本研究使用 CRISPick 工具（Broad Institute）来选择和设计sgRNA 序列。
结果
较高的TACC3与CA患者的疾病侵袭性相关，伴有CA的乳腺癌细胞对TACC3抑制非常敏感
为了分析TACC3在伴有CA的乳腺癌患者中的表达情况，本研究将CA20（一种基因特征）作为患者按CA状态进行分层的依据。
如图1所示，在METABRIC数据集[7]中，TACC3在CA20评分较高的乳腺癌肿瘤中表达水平更高，并且在高CA20表达的患者中，与TACC3较低表达的患者相比，TACC3较高表达的患者表现出更差的生存率（图1），表明TACC3可能对CA患者的临床结局至关重要。此外，本研究发现CA20得分和TACC3水平在HER2+乳腺癌和basal亚型乳腺癌中较高，且这两种亚型也是最具侵袭性的亚型（图1）。
图1 TACC3在不同CA20评分等级中的乳腺癌肿瘤表达水平
值得注意的是，在另一个有随访数据的患者队列（Hacettepe队列）研究中，研究人员发现高TACC3蛋白表达与TNBC亚型较差的总生存期显著相关（图2），进一步证实了TACC3在伴有CA的高侵袭性乳腺肿瘤中的作用。
图2 TACC3 与TNBC患者预后的相关性
在一组乳腺癌细胞系中，研究人员观察到带有CA的癌细胞系（主要为TNBC和HER2+乳腺癌）表达了更高水平的TACC3，并且对BO-264抑制TACC3更敏感（图3）。
图3 带有CA的癌细胞系能表达更高水平的TACC3
TACC3与CA患者的中心体聚集（CC）有关，并在伴有CA的癌细胞中介导CC
CC 是伴有CA的癌细胞双极分裂和存活所必需的关键过程。本次研究观察到，具有高CA20表达和高TACC3表达并因此生存率较差的患者，其CC得分较高（见图4）。
图4 在高CA20表达患者中，高TACC3与CC得分的相关性
为了证明TACC3在CC中的作用，本研究选择了两种伴有CA的乳腺癌细胞系（HER2+细胞系：JIMT-1和TNBC细胞系：MDA-MB-231）和两种非CA的细胞系（luminal A细胞系：MCF-7和TNBC细胞系：MDA-MB-468）作为阴性对照（图5）。虽然JIMT-I细胞中的TACC3敲除引起分散的中心体的多极细胞的百分比增加（图5）和随后的有丝分裂停滞（图5），但在MDA-MB-468细胞中，未有丝分裂停滞的多极细胞群落并没有增加。
图5 JIMT-I细胞和MDA-MB-468细胞在TACC3敲除后的不同结局
为了证明TACC3与由PLK4过表达引起的CA具有临床相关性，本研究分析了METABRIC数据集[7]，并显示PLK4 [其表达与CA20得分相关(图6)] 在HER2+和basal亚型中表达水平更高（图6）。具有高PLK4表达的患者表达了更高的TACC3 mRNA（图6），并伴有显著更差的总生存期（图6），这进一步验证了TACC3与伴有CA的癌症的临床相关性。
图6 TACC3与由PLK4过表达引起的CA的相关性
KIFC1是一种新型的TACC3结合蛋白，参与了TACC3介导的CC
本研究表明TACC3表达与KIFC1 mRNA显著正相关，而KIFC1 mRNA与METABRIC数据集中高CA20表达的乳腺癌患者的CC得分也具有相关性（图7）。值得注意的是，在这些患者中，与单个基因相比，高TACC3和高KIFC1的联合表达与更差的无远处复发生存期（DRFS）关联性更强（图7），提示KIFC1可能与TACC3共同作用介导CA细胞中的CC。
图7 KIFC1 mRNA与高CA20表达的乳腺癌患者CC得分的相关性
总的来说，KIFC1 和 TACC3 水平彼此间具有很强的关联性，并与伴有CA患者的CC 得分和生存率相关；KIFC1是有丝分裂细胞中TACC3的新型相互作用因子；TACC3-KIFC1复合物在介导伴有CA的癌细胞的CC和细胞存活方面起到了一定的作用。
通过FOXM1，p53缺失/突变增加了TACC3和KIFC1的表达，从而使癌细胞对TACC3抑制高度敏感
p53变异是肿瘤发生CA的主要原因之一[8]。此次研究有观察到p53突变（mut-p53）的细胞系出现CA的情况，并且对TACC3抑制剂BO-264更敏感（图8）。携带mut-p53的乳腺肿瘤表现出显著更高水平的CA20评分和TACC3 mRNA（图8）。与低TACC3表达的患者相比，携带mut-p53和高TACC3表达的乳腺癌患者的总生存期更差（图8）。
图8 携带mut-p53的乳腺肿瘤表现的CA20评分和TACC3 mRNA，以及对BO-264的敏感性
在测试p53缺失对CA的影响，并确定p53缺失或突变的癌细胞对TACC3抑制的敏感性方面，本研究发现在p53缺失后，CA细胞的百分比从9%增加到27%，证实了p53与CA之间的因果关系（图9）。与p53-wt细胞相比，TACC3抑制导致p53-/-细胞中的中心体不再聚集、多极有丝分裂和细胞活力降低（图9）。与此相一致的是，在TACC3抑制的作用下，与p53-wt细胞相比，p53−/−细胞观察到更强的有丝分裂阻滞和细胞凋亡诱导（图9）。
图9 p53缺失对CA的影响，及p53缺失或突变的癌细胞对TACC3抑制敏感性的影响
此外，与p53-wt细胞相比，TACC3和KIFC1在p53-/-细胞中的表达在蛋白质水平和mRNA水平上均有增加（见图10）。FOXM1是一种受p53抑制的转录因子，并负责转录与有丝分裂相关的基因[9]。基于METABRIC数据集的分析显示，在携带mut-p53的乳腺肿瘤中，FOXM1明显过表达（图10）。在p53-mut患者中观察到F0XM1和TACC 3/KIFC1 mRNA之间的显著正相关性（图10），表明F0XM1可能是高CA、p53-mut肿瘤中TACC3和KIFC1的潜在上游调控因子。
图10 在携带mut-p53的乳腺肿瘤中，FOXM1的过表达
总的来说，p53缺失/突变通过FOXM 1增加TACC3和KIFC1的表达，并使癌细胞对TACC3抑制高度敏感。
TACC3在伴有CA的间期细胞中与核小体重塑和去乙酰化酶（NuRD）复合物的成员相互作用，抑制这种相互作用会导致G1期阻滞和细胞凋亡
为了测试TACC3在伴有CA的癌细胞中是否有促进细胞周期进程的新功能，本研究使用胸腺嘧啶核苷双阻断法将JIMT-1细胞同步到G1期，然后释放到新鲜或含有BO-264的培养基中。当释放到新鲜培养基中的细胞通过G1期进展到S期时，释放到含有BO -264的培养基中的细胞停滞在G1期（图11）。除了在有丝分裂中的作用外，TACC3在G1/ S进程中可能也起着至关重要的作用，这导致伴有CA的癌细胞大量的凋亡。此外，在TACC3抑制下的G1阻滞介导的细胞凋亡性地死亡之前，在伴有CA或CA诱导的细胞中，CDK抑制剂和凋亡诱导剂的mRNA水平被强烈诱导（图11）。
图11 在伴有CA的癌细胞的有丝分裂和G1/ S进程中，TACC3所起的作用
NuRD复合物是一种重要的染色质重构复合物，它在转录、染色质组装、细胞周期进程和基因组稳定性等方面起着重要作用[10, 11]。除了已知的MBD2，本研究还鉴定了NuRD复合物成员之一的HDAC2作为TACC3的新型相互作用因子（图12）。此外，本研究发现了G1同步化细胞中内源性TACC3、MBD2和HDAC2之间的相互作用，这种相互作用在TACC3抑制剂短期治疗后会降低（图12）。
图12 TACC3在伴有CA的间期细胞中与NuRD复合物成员的相互作用
为了阐明TACC3抑制在增加肿瘤抑制因子转录上的机制，研究人员检测了在TACC3抑制存在和不存在的情况下，TACC3与MBD2和HDAC2的共定位情况。本研究发现由于TACC3与NuRD复合物相互作用的丧失，从而引起肿瘤抑制因子的转录激活参与了细胞的凋亡，这种细胞凋亡发生在伴有CA的癌细胞中，在TACC3抑制下，并且由G1期阻滞介导。
总的来说，这些数据表明TACC3与伴有CA的间期细胞中的NuRD复合物的成员相互作用，并且抑制这种相互作用会导致G1期阻滞和细胞凋亡。
靶向TACC3可抑制伴有CA的乳腺肿瘤的生长
为了测试TACC3抑制对体内携带CA的肿瘤生长的影响，本研究在MDA-MB-231细胞和JIMT-1细胞中进行了CRISPR Cas9介导的TACC3敲除，并通过Western blotting验证了TACC3的去除（见图13）。TACC3敲除显著降低了细胞的克隆形成能力（图13）。如图13所示，TACC结构域（594-838）足以诱导细胞形成克隆，其效果与全长相似，而N端区域（1-593）未见细胞转化能力的增加。
图13 TACC3敲除对MDA-MB-231细胞和JIMT-1细胞的影响
为了测试TACC3基因敲除对体内肿瘤生长的影响，研究人员将sgCtrl（对照组）和sgTACC3（TACC3基因敲除组）转染到JIMT-1和MDA-MB-231细胞中，然后将这些细胞注射到裸鼠的乳腺脂肪垫（MFP）中，监测肿瘤的生长情况。如图14所示，TACC3基因敲除减少了伴有CA的肿瘤生长。重要的是，多极纺锤体的数量在TACC3敲除的肿瘤中更高（图14），这导致了有丝分裂停滞和细胞凋亡（见图14）。可见，TACC3抑制显著减少了肿瘤的生长，且没有观察到任何毒性反应（图14）。
图14 TACC3基因敲除对体内伴有CA的乳腺肿瘤生长的影响
总的来说，在体内，TACC3抑制介导的细胞死亡机制与体外相同，并且TACC3抑制在具有CA的肿瘤中代表一种新的易感性。
结论
本研究认为TACC3是一种新型的CC介导物和转录调节因子，在伴有CA的高侵袭性肿瘤中过度表达，并与严重恶化的临床结局有关。TACC3可能是一种治疗高侵袭性癌症的新型药物靶点。TACC3在伴有CA的肿瘤中的表达水平较高，其抑制可以有效地阻止细胞增殖，并且在体内没有明显的毒性。基于这些临床前发现以及临床数据，为了改善伴有CA的高侵袭性癌症患者的临床结局，开展TACC3抑制剂的临床测试很有必要。
[1] Saatci O, Akbulut O, Cetin M, Sikirzhytski V, Uner M, Lengerli D, O'Quinn EC, Romeo MJ, Caliskan B, Banoglu E, Aksoy S, Uner A, Sahin O. Targeting TACC3 represents a novel vulnerability in highly aggressive breast cancers with centrosome amplification. Cell Death Differ. 2023 Mar 2. doi: 10.1038/s41418-023-01140-1. Epub ahead of print. PMID: 36864125.
[2] Song H, Liu C, Shen N, Yi P, Dong F, Li X, et al. Overexpression of TACC3 in Breast Cancer Associates With Poor Prognosis. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2018;26:113–9.
[3] Jiang F, Kuang B, Que Y, Lin Z, Yuan L, Xiao W, et al. The clinical significance of transforming acidic coiled-coil protein 3 expression in non-small cell lung cancer. Oncol Rep. 2016;35:436–46.
[4] L’Esperance S, Popa I, Bachvarova M, Plante M, Patten N, Wu L, et al. Gene expression profiling of paired ovarian tumors obtained prior to and following adjuvant chemotherapy: molecular signatures of chemoresistant tumors. Int J Oncol. 2006;29:5–24.
[5] Ding ZM, Huang CJ, Jiao XF, Wu D, Huo LJ. The role of TACC3 in mitotic spindle organization. Cytoskeleton. 2017;74:369–78.
[6] Singh P, Thomas GE, Gireesh KK, Manna TK. TACC3 protein regulates microtubule nucleation by affecting gamma-tubulin ring complexes. J Biol Chem. 2014;289:31719–35.
[7] Curtis C, Shah SP, Chin SF, Turashvili G, Rueda OM, Dunning MJ, et al. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 2012;486:346–52.
[8] Fukasawa K, Choi T, Kuriyama R, Rulong S, Vande Woude GF. Abnormal centrosome amplification in the absence of p53. Science. 1996;271:1744–7.
[9] Barsotti AM, Prives C. Pro-proliferative FoxM1 is a target of p53-mediated repression. Oncogene. 2009;28:4295–305.
[10] Lai AY, Wade PA. Cancer biology and NuRD: a multifaceted chromatin remodelling complex. Nat Rev Cancer. 2011;11:588–96
[11] Zhang Y, Ng HH, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Bird A, Reinberg D. Analysis of the NuRD subunits reveals a histone deacetylase core complex and a connection with DNA methylation. Genes Development. 1999;13:1924–35.
排版编辑：肿瘤资讯-饶运双
苏公网安备32059002004080号
