液体活检生物标志物，如循环肿瘤细胞（CTC）和无细胞DNA（ctDNA），是无创性的诊断方法，可以补充目前临床上使用的预测和预后工具。最近的免疫疗法显示有希望改善一部分乳腺癌患者的预后。生物标志物可以通过识别那些更有可能对免疫疗法产生反应的癌症患者来提高免疫检查点抑制剂的疗效。近日，frontiers in oncology杂志发表了一篇综述，文章讨论了当前液体活检和新兴技术在评估乳腺癌免疫疗法反应和结果方面的应用，并对乳腺癌免疫治疗的现状进行了概述。
1. 前言
肿瘤学中的预测性和预后性生物标志物在指导治疗以改善患者预后方面发挥了重要作用。最近出现的基于液体活检的血液生物标志物，如循环肿瘤细胞（CTC）和无细胞DNA（ctDNA），为评估早期和转移性乳腺癌的肿瘤反应及生存率提供了微创检测方法。由于更易获得，基于血液的生物标志物解决了基于组织的生物标志物所带来的局限性。
乳腺癌是妇女最常见的癌症，三阴性乳腺癌（TNBC）占所有乳腺癌的15%至20%，且常预后不佳。针对程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）和程序性死亡配体1（PD-L1）的免疫检查点抑制剂（ICI）药物与化疗相结合，在早期和转移性TNBC中表现出明显的临床获益。然而，在转移性患者中，只有部分患者对这些药物有反应。
目前，对转移性TNBC患者一线免疫治疗的唯一预测性检测是PD-L1表达的免疫组化（IHC）检测。但PD-L1检测目前缺乏标准化，确定敏感和特异的预测性生物标志物以选择将从ICI治疗中受益的患者的需求尚未得到满足。基于此，本文讨论了液体活检在指导免疫疗法治疗乳腺癌方面的应用，其中重点讨论CTCs和ctDNA，以及检验其效用的临床研究（图1）。
图1 循环肿瘤细胞 (CTC) 和循环肿瘤 DNA (ctDNA) 作为免疫治疗的生物标志物
2. 液体活检生物标志物
循环肿瘤细胞（CTC）
CTC指原发肿瘤脱落到血液中的稀有细胞，被假设为远处转移的前体。 许多研究明确证明了这些细胞在早期和转移性乳腺癌中的预后价值。已证实每 7.5 mL 血液中检测到 5 个或更多 CTC 对转移性乳腺癌患者的无进展生存期 (PFS) 和总生存期 (OS) 具有强烈的预后意义 。最近测试了CTC 在早期乳腺癌中的预后价值，与未检测到 CTC 的患者相比，在新辅助治疗前发现一种或多种 CTC 的患者局部和远处复发的风险增加。
循环肿瘤DNA （ctDNA） 和无细胞DNA （cfDNA）
ctDNA 是源自原发性肿瘤、转移灶和/或循环肿瘤细胞的 DNA 短片段。 ctDNA 可以在血浆中检测到，并且存在于主要来自正常血细胞的 DNA 混合物中，这种混合物被称为无细胞DNA (cfDNA)。 可以使用多种方法检测 ctDNA，包括深度二代测序（图 2）。
早期乳腺癌患者血液中 ctDNA 的存在与侵袭性疾病有关，并预示着不良的临床结果。在新辅助或辅助治疗期间未能清除 ctDNA 反映了治疗耐药性和转移性复发风险增加。
最近定义的 ctDNA 在转移性乳腺癌中的临床应用涉及检测磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 3-激酶催化亚基 α (PIK3CA) 突变，该突变已被FDA批准用于指导治疗。研究还在评估使用 ctDNA 检测治疗期间可能代表早期耐药迹象的新突变，例如ESR1 突变。
图2 血浆中ctDNA检测
3. 乳腺癌的免疫治疗
免疫检查点阻断有助于免疫系统识别和攻击肿瘤细胞，被用于治疗各种癌症。单克隆抗体通过抑制PD-L1/PD-1轴提供细胞介导的抗肿瘤活性。
转移性TNBC的主要治疗方法是化疗，但越来越多的证据表明对于PD-L1阳性的TNBC免疫疗法有临床获益。更高的TILs水平、更多的非同义突变以及肿瘤和免疫细胞上更高的PD-L1表达水平使TNBC比其他乳腺癌亚型更有可能对ICI产生反应。
虽然TNBC的反应高于激素受体阳性（HR+）和HER2+乳腺癌，但ICI单药的疗效仍然很低。阿替利珠单抗和帕博利珠单抗单药治疗的反应率在预先治疗的患者中约为5%，而在未经治疗的转移性TNBC患者中约为21%。ICI单药治疗的低反应率引起了对免疫治疗和化疗联合治疗的疗效的研究。
目前正在研究ICI与PARP抑制剂、AKT抑制剂、MEK抑制剂、抗体药物结合物和免疫调节药物等其他几类药物的组合，以增强宿主的免疫反应，扩大在转移性环境中可从ICI获益的患者亚群（NCT03167619，NCT04191135）。
3.2早期乳腺癌
在早期阶段，新辅助化疗使II期和III期TNBC和HER2+乳腺癌的治疗得到了明显的改善。病理完全反应（pCR）的改善与良好的预后有关，对没有pCR的患者进行手术后治疗，减少了这种高危患者群体的复发可能性。II期I-SPY2试验令人鼓舞的结果，以及PD-L1阳性和TILs与pCR的关系，推动了ICI在早期TNBC的使用。
III期KEYNOTE-522试验证实加入帕博利珠单抗改善三年的EFS（从76.8%到84.5%），且在没有获得pCR的患者中，使用帕博利珠单抗可以改善EFS，而获得pCR的患者在新辅助治疗后的治疗组中也有极好的效果。III期试验IMpassion031试验也证实无论PD-L1表达情况如何，添加阿替利珠单抗与pCR的显著增加有关（从41.1%到57.6%，p=0.0044）。
4. CTCs在乳腺癌免疫治疗中的预测和预后价值
尽管PD-L1的存在已被证明对转移性TNBC的ICI疗效具有良好的预测价值，但仍存在许多挑战。比如：由于缺乏可用的组织PD-L1免疫组化评估不可行、PD-L1阳性的肿瘤患者对ICI没反应以及肿瘤微环境中PD-L1表达的异质性和动态变化。为解决这些问题，目前正在积极研究转移性乳腺癌患者CTC上的PD-L1表达，可能补充或取代肿瘤组织中肿瘤细胞和/或TILs上的PD-L1检测。
液体活检微创、成本低，并能迅速为临床医生提供信息以指导治疗决策，还可以在疾病的过程中纵向重复，在ICI治疗期间及之后提供随访数据，并可以帮助检测抗性机制。与组织样本中的局部细胞的评价相比，CTCs能更好地代表PD-L1表达的系统性。
许多研究评估了接受ICI治疗的患者中PD-L1阳性CTCs的预测和预后价值。Nicolazzo等人的研究认为PD-L1阴性CTCs的患者均有临床获益，而PD-L1阳性CTCs的患者则出现疾病进展。Strati等人的研究认为，在治疗结束时CTCs过度表达PD-L1的患者PFS和OS较短。这些研究证明了在CTCs中进行PD- L1检测的可行性，并提供了表达PD-L1的CTCs的预测和预后价值的证据。
表1总结了关于接受免疫治疗的乳腺癌患者的CTCs研究。Mazel等人评估了HR+、HER2阴性乳腺癌患者中PD-L1的表达频率（图3），结果提示表达PD-L1的CTCs可以预测对抗PD-L1治疗的反应，而具有高比例的PD-L1阳性CTCs的患者可以成为抗PD-L1治疗的潜在候选人。
表1 接受免疫治疗的乳腺癌患者的CTCs研究
图3 循环肿瘤细胞（CTCs）中的PD-L1表达评估
Schott等人研究结果提示PD-L1阳性CTCs的比例明显高于PD-L2阳性CTCs（54.6%对28.7%；P<0.001）。在没有转移性病灶的患者中也检测到了PD-L1阳性的CTCs，提示可以扩大PD- L1检测CTCs在早期阶段的应用。此外，转移性乳腺癌患者的PD-L1阳性CTC明显更多（中位数75% vs 61%；P<0.05）。在ICI治疗期间对ICI治疗有反应的患者的CTCs数量和PD-L1阳性CTCs的百分比都有所下降，停止后百分比持续增加。这些结果表明PD-L1阳性CTCs的数量可能是预后性的，并与肿瘤的侵略性以及对免疫疗法的潜在反应相关。
CD47是一个关键的免疫检查点，它在各种癌细胞上高度表达，使肿瘤细胞对宿主的免疫监视产生抵抗。Agelaki等人的研究显示，高CD47和/或高PD-L1 CTCs与复发风险增加有关，高PD-L1 CTCs与死亡风险高有关（HR 4.8；p=0.011）。具有这些CTC生物标志物阳性人群的患者可以从抗CD47和抗PD-L1免疫治疗策略中获益。
5. ctDNA在乳腺癌免疫治疗中的预测和预后价值
血液中检测到的ctDNA已被证明可以反映原发肿瘤的突变特征。基线ctDNA浓度和基因组不稳定数已被证明可以预测对ICI的反应，ctDNA监测可能在未来成为指导治疗的宝贵工具。鉴于ctDNA的遗传分析是可行的，评估TMB也成为可能，这可能是癌症免疫治疗的一个新的生物标志物。Araujo等人证明，高TMB可以预测转移性乳腺癌患者的ICI疗效。也有研究表明，来自ctDNA的高MSI与各种癌症对ICI的良好反应有关。此外，检测cfDNA中调节肿瘤特异性免疫反应的体细胞突变可能有助于识别无反应的患者。
表2总结了关于接受免疫疗法的乳腺癌患者ctDNA的研究。INSPIRE研究表明，使用定制的检测方法进行连续的ctDNA分析可以作为ICI治疗患者的监测策略。在I-SPY2早期乳腺癌试验中，两组ctDNA的检测都随着时间的推移而减少。所有获得pCR的患者（n=34）在手术前ctDNA完全清除，未能达到pCR的患者中，与ctDNA阳性的患者相比，手术前清除ctDNA的患者的远期无复发生存率（DRFS）明显较高。
表2 接受免疫治疗的乳腺癌患者ctDNA的研究
6. 新兴液体活检技术
除了检测肿瘤突变DNA分子（即ctDNA）外，其他基于cfDNA的生物标志物也正在开发中。Cristiano及其同事描述了一种对全基因组的cfDNA片段模式进行分析的方法，也被称为 "片段组学"。作者认为片段分析与基于突变的分析相结合，可以准确区分癌症患者和健康人。另一种方法是对cfDNA进行甲基化测序。这种方法包括生成全基因组地图，显示 核糖体占有率和评估转录因子在cfDNA小片段中的结合。
此外，研究者开发了一种新的指标--基因组不稳定数（GIN），可用于监测对免疫治疗药物的反应，包括区分进展与假性进展。GIN检测和其他检测全基因组的新技术在提供临床相关信息方面显示出前景，超过了单独的ctDNA所能提供的。
7. 总结
总之，液体活检是一种很有前途的技术，是对接受ICI治疗的乳腺癌患者的PD-L1表达进行动态评估和序贯监测的可行策略。鉴于对乳腺癌患者的研究数量较少，进一步的临床研究来证明液体活检在指导乳腺癌免疫治疗中的作用，也需要更多的生物标志物来完善其预测和预后价值。
Magbanua M J M, Gumusay O, Kurzrock R, et al. Immunotherapy in Breast Cancer and the Potential Role of Liquid Biopsy[J]. Frontiers in Oncology, 2022, 12: 802579-802579.
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