首页 > 文章详情

新型aLC-MS方法可快速监测复杂基质中ADC质量属性，助力生物制药产品开发与生物分析

04月01日

整理：肿瘤资讯

来源：肿瘤资讯

抗体偶联药物（ADC）兼具高度复杂的化学特性与结构特征。这种复杂性带来了极高的分析壁垒，迫切要求在研发阶段实施完善的多层次分析控制策略。为解决当前ADC在复杂生物基质中转录后修饰分析需离线富集、色谱分离复杂，且通量低、数据处理繁琐的问题，来自法国和丹麦的研究团队开发了一种基于POROS CaptureSelect FcXL柱的天然亲和液相色谱-质谱（aLC-MS）方法，用于血清等复杂样品基质中ADC及其他抗体衍生形式的直接分析。该方法线性良好、灵敏度高，可快速测定药物抗体比、药物负载分布及相对药物丰度，无需色谱峰积分，且数据处理易于自动化。

研究背景

ADC是靶向抗癌药物，结合了单克隆抗体的抗原特异性和小分子药物的强细胞毒性，是肿瘤学中发展最快的治疗性生物制剂之一。其结构由单克隆抗体、细胞毒性载荷和连接子三部分组成，给药后通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞，释放活性药物诱导细胞死亡。ADC化学和结构复杂，异质性源于连接子-载荷（L/P）和抗体本身的多种修饰，这对分析技术提出了很高要求，液相色谱-质谱联用（LC-MS）是其表征和质量属性监测的关键技术。目前复杂生物基质中ADC的LC-MS分析方法多需复杂样品制备、反相色谱分离和手动峰积分，限制了通量并增加了自动化难度，因此亟需一种更高效、简便的分析方法。

研究方法

本研究采用实验研究设计，开发并优化aLC-MS方法，以POROS CaptureSelect FcXL柱为核心，搭配优化的溶剂和质谱参数，实现复杂样品基质中ADC的直接分析。实验所用试剂包括LC-MS级氨水、冰醋酸、甲酸等，仪器主要为Thermo Scientific Orbitrap Exploris 240质谱仪和Vanquish Horizon超高效液相色谱系统等。ADC样品来自内部项目，为带有四个工程化半胱氨酸的人IgG1抗体，通过马来酰亚胺化学进行位点特异性缀合。实验设置稳定性研究和浓度梯度实验，以BALB/c小鼠血清为复杂样品基质，PBS为对照基质；稳定性研究中，血清和PBS样品分别加入ADC至终浓度1.8mg/mL和0.5mg/mL，37℃孵育0、2、4天，冷冻保存待分析；浓度梯度实验制备125-2000μg/mL和31.25-1000μg/mL两个ADC血清稀释系列。样品分析前进行去糖基化处理，优化色谱柱、洗脱溶剂和质谱参数，通过aLC-MS测定药物负载（DL）、药物抗体比（DAR）和药物负载分布（DLD），结合SMART消化和纳流LC-MS/MS进行肽图分析验证结果。主要终点为aLC-MS方法的线性、灵敏度和特异性，次要终点为ADC在血清和PBS中的稳定性及生物转化特征。

研究结果

色谱柱优化结果显示，POROS CaptureSelect FcXL亲和色谱柱（FcXL柱）在峰对称性、尖锐度和强度上优于MabPac Protein A柱，且对人IgG的选择性更高，肽图分析证实其可减少血清中杂蛋白的干扰，因此确定为核心色谱柱。

图片1.png

图1 两种亲和色谱柱分离ADC的对比图谱

图片2.png

图2 两种色谱柱分离后血清杂蛋白干扰的肽图分析对比

洗脱溶剂优化结果显示，甲酸溶剂比乙酸溶剂能获得更尖锐的色谱峰和更高的紫外信号强度，但乙酸溶剂能产生更集中、更接近天然状态的电荷态分布，最终选择乙酸作为洗脱溶剂，且溶剂B摩尔浓度不超过87mM，90%溶剂B洗脱时整体性能最佳。

质谱参数优化结果显示，吹扫气设为0L/min可避免MS信号强度降低，气化器温度200-250℃时信号强度最佳且无明显L/P断裂，源内碰撞诱导解离（isCID）设为70-80V可避免加合物形成和过度L/P断裂，该优化参数在多种Orbitrap平台上表现一致。

浓度梯度实验结果显示，aLC-MS方法在125-2000μg/mL血清浓度范围内线性良好（R²=0.99），灵敏度可达31.25μg/mL，即使在ADC占血清总蛋白比例仅0.25%的低浓度下，仍能获得良好的MS信号，且DAR和DLD结果稳定。

图片3.png

图3 aLC-MS方法检测ADC的线性关系图

图片4.png

图4 不同ADC血清浓度的MS信号及DAR稳定性对比

稳定性研究结果显示，ADC在PBS中稳定性良好，DAR和DLD结果一致；在血清中稳定性较差，随着孵育时间延长，低药物负载形式增加，DAR略有降低，孵育4天时药物4型相对信号强度从100%降至28%。

图片5.png

图5 ADC在PBS和血清基质中不同孵育时间的DLD变化

肽图分析结果显示，血清中ADC的连接子-载荷水解增加，工程化半胱氨酸上的游离半胱氨酸水平升高，证实血清中存在马来酰亚胺水解和二硫键交换反应，这是ADC生物转化的主要机制。

研究结论

本研究开发的aLC-MS方法无需复杂样品制备，可直接对血清等复杂基质中的ADC进行快速、高选择性分析，仅基于MS数据即可完成DAR、DLD等关键质量属性的测定，数据处理和报告易于自动化。该方法的线性和灵敏度满足生物制药开发和生物分析的需求，可实现ADC质量和数量的同步监测，适用于下一代更复杂的ADC（如双特异性ADC）的分析。该aLC-MS方法为复杂基质中ADC的快速、高效表征提供了新方案，可支持生物制药产品开发和生物分析应用。

参考文献

Dan Bach Kristensen, Nanna Sofie Eskesen, Clara Coll-Satue, et al. Rapid and selective characterization of antibody-drug conjugates in complex sample matrices by native affinity liquid chromatography-mass spectrometry. mAbs, 2026, 18(1): 2618314. DOI: 10.1080/19420862.2026.2618314.

审批编号：CN-180176 有效期：2026-6-16

声明：本材料由阿斯利康提供，仅供医疗卫生专业人士进行医学科学交流，不用于推广目的。

责任编辑：肿瘤资讯-Yuno
排版编辑：肿瘤资讯-Sally