近日，发表在《英国肿瘤学杂志》（British Journal of Cancer）上一篇题为Peritoneal metastases from colorectal cancer belong to Consensus Molecular Subtype 4 and are sensitised to oxaliplatin by inhibiting reducing capacity的文章，通过基于临床样本的分子分析和体外建模，解析了腹膜转移性结直肠癌的铂类耐药机制，并提供了潜在解决方案。
研究背景
对转移性结直肠癌进行全身化疗可将中位总生存期延长至2年以上；这种治疗获益依赖的分子机制尚不明确，可能与肿瘤生物学/药物暴露的差异有关。然而，存在腹腔转移的患者与其他部位发生转移的患者相比，从系统化疗中得到的获益显著减少。学界认为，结直肠癌的腹膜转移与治疗耐药和不良的生存结局密切相关。奥沙利铂单药方案曾被广泛应用于腹膜转移患者的腹腔内治疗，但未能产生确切的临床获益。该研究旨在通过对临床分型及分子机制的探索，确定腹膜转移造成奥沙利铂耐药的潜在影响机制，并制定克服这种耐药的治疗策略。
研究方法
该研究通过来自12名患者的35个原发肿瘤样本和59个腹膜转移样本构建了一个生物信息库；所有样本均进行了RNA测序进行分析。基于RNA表达模式，结直肠癌可分为四种共识分子亚型（CMS1-4）。其中，共识分子亚型4（CMS4）被认为与结直肠癌的间充质表型、预后差以及全身治疗反应不佳有关。该亚型可通过四基因PCR检测被识别出来。
该研究发现，腹膜转移表现出多种侵袭性结直肠癌生物学特征；而绝大多数的腹膜转移和相应的原发肿瘤均属于CMS4亚型。针对该分型，本研究使用荷兰PIPAC研究中患者腹腔液体产生的腹膜转移细胞，进行类器官培养，生成了一系列体外腹膜转移样本衍生的类器官（PMDO）平台，以模拟腹膜转移结直肠癌患者对治疗的反应，进而探索相关分子机制、设计和检测克服奥沙利铂耐药性的治疗方案。
研究结果
1. 腹膜转移与结直肠癌的侵袭性相关
该研究纳入了12例计划接受手术的腹膜转移结直肠癌患者，收集了来自他们的35个原位癌样本和59个相应的腹膜转移样本，并基于这94例组织样本建立了一个生物信息库。对RNA测序结果进行的t-分布随机近邻嵌入（t-SNE）分析显示，来自同一患者的转移部位和原发肿瘤样本存在一致的聚类，没有出现特定的腹腔亚部位聚类；这提示患者肿瘤的内外在遗传变量存在整体性，即对于结直肠癌而言整体基因表达的变化是更重要的决定因素。
随后，基于结直肠癌细胞Hallmark印记（一种用于表述癌症表型和基因型复杂性的临时集合）和免疫细胞的基因组富集分析，将所有在腹膜转移部位或原位癌样本中显著富集的基因罗列了出来。通过分析差异激活的50个Hallmark基因印记，该研究确定了15个相较于原位癌在腹膜转移部位显著过表达的基因通路，包括转化生长因子β（TGF-β）通路、血管生成通路、补体激活通路和上皮间质转化（EMT）通路。其中，TGF-β通路的高度激活与结直肠癌的纤维化反应相关；而与原位癌相比，基质成纤维细胞、细胞外基质重构和局灶性粘连信号也确实在腹膜转移部位存在更高表达。与之相较，WNT信号靶基因和MYC靶基因的表达在腹膜转移灶显著降低。至于免疫细胞类型，与原发病灶相比，腹膜转移部位的未成熟树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和NK细胞信号显著更高，辅助性T细胞17（Th17）则明显减少。
图1 结直肠腹腔转移的分子分析显示肿瘤侵袭性行为具有多重特征
2. 腹膜转移性结直肠癌与CMS4型结直肠癌为同质实体
既往研究报道，大部分腹膜转移性结直肠癌属于CMS4分型，而本研究的结果进一步确证了这一点。RNAseq数据显示，腹膜转移性结直肠癌存在显著的CMS4分型富集；统计学分析同样体现了采样患者的基因表达与CMS4分型基因组存在相关性。
尽管几乎所有接受分析的样本都被归类为CMS4分型，转移部位样本与原位癌样本之间仍然存在着一定的差异。基因表达分析表明，在腹膜转移灶中有366个基因的表达明显高于相应的原位癌样本，原位癌样本则存在138个基因的过表达。针对相关基因的归集显示，腹膜转移灶和原位癌的主要生物学差异在于，腹膜转移部位更倾向于极端的间充质表型；这些腹膜转移性结直肠癌被认为构成了大部分的CMS4分型，同时预后更差。
针对腹膜转移灶中366个过表达的基因，该研究进一步开展了转录因子结合位点的分析，结果显示ZEB1的下游基因在这些基因中大量富集；与原发肿瘤相比，ZEB1本身在腹膜转移灶中的表达也显著增高。这提示，作为EMT通路中的关键因子，ZEB1可被作为识别CMS4型结直肠原位癌的潜力标志物。
图2 腹膜转移性结直肠癌患者的原位癌及转移灶均呈现CMS4分型
3. 腹膜转移性结直肠癌存在高谷胱甘肽合成，并对奥沙利铂耐药
CMS4型结直肠癌对系统性治疗的常用药物存在耐药倾向，包括铂类治疗。最近发表的PRODIGE 7研究表明，在腹膜转移性结直肠癌患者术后接受奥沙利铂腹腔内治疗获益不佳。本研究设计的PMDO平台，在培养过程中接受了一系列固定剂量的奥沙利铂（1、100、200、300、400、500 μM）暴露。其后1小时至3天内的剩余活细胞比例检测显示，腹膜转移性结直肠癌细胞衍生的类器官相较于非腹膜转移的样本存活率更高，对奥沙利铂的耐药性更强。
CMS4分型结直肠癌对铂类治疗的耐药，与肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和N-乙酰半胱氨酸（NAC）主导的谷胱甘肽合成途径密切相关；该途径能够产生诱发耐药的半胱氨酸、谷胱甘肽。同时，谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCLC）是该合成途径的关键限速酶。针对PMDO及非腹膜转移性结直肠癌细胞的检测显示，GCLC的mRNA及蛋白质表达水平均在PMDO中显著上调。此外，CMS4分型的特征基因主要由肿瘤相关成纤维细胞表达，在原发肿瘤或PMDO中则大部分缺失。这提示，阻断谷胱甘肽合成途径有望恢复腹膜转移性结直肠癌对铂类治疗的敏感性。
图3 PMDO培养显示出奥沙利铂耐药并高表达GCLC
4. NAC缺失使PMDO对奥沙利铂恢复敏感
为证实谷胱甘肽合成途径是否可以调节腹膜转移性结直肠癌对奥沙利铂的耐药性，本研究比较了PMDO在添加或移除NAC的环境中的生长情况。结果显示，在缺乏NAC的情况下，PMDO对奥沙利铂治疗的敏感性更高；且NAC缺乏情况下使用短时间奥沙利铂治疗（1小时），比在添加NAC的环境中使用奥沙利铂长程治疗（72小时）效果更好。
然而，奥沙利铂处理结束后，所有PMDO都有效地恢复了生长。再生长分析显示，72小时处理组的恢复潜力显著降低。因此，尽管NAC缺失环境能够显著增加PMDO对奥沙利铂的敏感性，但短期治疗不足以产生持久的抗肿瘤作用。
图4 NAC缺乏使PMDO对奥沙利铂敏感
5. 抑制谷胱甘肽合成有望实现短期奥沙利铂治疗根除PMDO
为进一步探索谷胱甘肽合成通路作为潜在治疗靶点的可行性，该研究使用CRISPR-CAS9技术，删除了CMS4分型衍生的类器官中的GCLC催化亚基。这种基因敲除导致缺失GCLC的类器官对奥沙利铂敏感，且这种敏感能够被外源还原性谷胱甘肽的添加转化为耐药。
此外，该研究还基于PMDO探索了其对5-氟尿嘧啶（5-FU）和伊立替康的敏感性，结果显示GCLC基因敲除对PMDO的药物反应性没有显著影响。这也表明谷胱甘肽合成通路是PMDO对奥沙利铂敏感性的重要决定因素，而非对5-FU或伊立替康敏感性的重要决定因素。
除基因敲除手段外，本研究还尝试了通过药理学手段阻断谷胱甘肽的合成。使用丁硫氨酸亚砜胺（BSO）这种GCLC抑制剂处理后，PMDO的内源性谷胱甘肽水平显著下降；奥沙利铂与BSO联合使用时，两种不同的PMDO培养物完全消失。这些结果提示了联合用药方案的可能性；当然，抑制谷胱甘肽的合成是实现这一目标的必要条件。
图5 GCLC敲除增加了PMDO对奥沙利铂的敏感性
图6 BSO处理使PMDO对短期奥沙利铂治疗敏感
研究讨论
腹膜转移性结直肠癌表现出多种侵袭性生物学特征。本研究证实，绝大多数的腹膜转移和相应的原发肿瘤都属于CMS4分型。PMDO表达高水平的GCLC，并通过谷胱甘肽合成途径诱发对奥沙利铂的耐药性。通过遗传或药理学途径，靶向抑制GCLC及谷胱甘肽合成途径，能够使PMDO对奥沙利铂治疗敏感，并有望实现基于短时间铂类联合治疗达到根治效果。
本研究的结果在一定程度上解释了PRODIGE 7研究中，基于奥沙利铂的腹腔热灌注疗法（HIPEC）未能为可手术的腹腔转移性结直肠癌患者取得生存获益的原因，并说明作为一种潜在有效的治疗策略，PRODIGE 7研究使用的辅助HIPEC依然值得改进与尝试。基于本研究中联合治疗策略在PMDO培养中获得的积极结果，在以奥沙利铂为基础的HIPEC方案中加入降低肿瘤细胞还原能力的药物，或将提高治疗效果，并改善腹膜局部疾病控制。
本研究尝试的联合方案为奥沙利铂+BSO；然而，由于BSO在体内半衰期较短、降低肿瘤组织中谷胱甘肽水平的能力不佳，已经不再被临床应用。针对谷胱甘肽合成通路，另一种替代药物APR-246目前正在进行相关临床试验。此外，靶向硫氧还蛋白途径也可能进一步与谷胱甘肽合成通路的靶向药物协同降低肿瘤细胞的还原能力，使其对奥沙利铂敏感，提高局部治疗效果。因此，Auranofin（一种硫氧还蛋白还原酶的有效抑制剂）也正在多个临床研究中接受评估。
除奥沙利铂外，丝裂霉素C（MMC）也常被应用于HIPEC，该药物也可能通过谷胱甘肽合成途径引发耐药。这表明本研究确定的联合治疗策略可能对基于奥沙利铂和基于MMC的HIPEC都有益。未来的研究应对MMC与氧化还原靶向药物联合治疗PMDO的潜在协同效应展开探索。
此外，本研究针对腹膜转移性结直肠癌组织的大规模RNAseq分析，为治疗策略的设计提供了更多额外的思路，并非局限于奥沙利铂方案。如前所述，TGF-β等多种信号通路在腹膜转移灶中表达水平异常，这些信号通路都与晚期肿瘤的疾病进展与转移存在紧密关联。抑制腹膜转移灶中异常上调的信号通路，可能有助于更好地治疗包括腹膜转移在内的CMS4型结直肠癌。同时，原位癌组织和腹膜转移灶之间的肿瘤免疫微环境差异，也通过免疫细胞基因组检测显露出来。单核细胞、巨噬细胞和未成熟的树突状细胞的富集，以及Th17细胞的显著减少，都可能为后续研究奠定基础。鉴于巨噬细胞尤其与侵袭性肿瘤行为有关，且与CMS1-3相比，巨噬细胞在CMS4分型中富集，因此巨噬细胞靶向治疗可能对腹膜转移性结直肠癌的治疗有潜在价值。
总之，本研究通过结合对临床样本的分子分析和基于PMDO的实证试验，确定了腹膜转移性结直肠癌中奥沙利铂耐药的一个主要途径，并提供潜在有效的联合治疗策略来克服这种耐药。GCLC在所有PMDO中普遍高表达，提示降低肿瘤细胞的还原能力可能广泛适用于腹膜转移患者；奥沙利铂联合氧化还原靶向药物的治疗方法值得在加压腹腔内气溶胶化疗（PIPAC）或HIPEC程序中进行临床评估，且短期暴露就有望实现长期的抗肿瘤效果。
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