肺癌是全世界死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的85%[1,2]。据统计，30-50%的NSCLC患者在疾病进展期间有脑转移（BM），由于治疗方案局限NSCLC-BM患者预后较差，总中位生存时间在1.5~9.5个月左右[3,4]。研究表明，小胶质细胞在脑转移（BM）中发挥着重要作用。然而，活化的小胶质细胞如何促进非小细胞肺癌（NSCLC）脑转移的潜在机制尚不明确。因此，研究其转移定植机制对于确定新的治疗方向、改善NSCLC-BM患者的生活质量至关重要。
近日，Signal Transduction and Targeted Therapy杂志上发表了华中科技大学袁响林教授和王玮教授团队的一项研究，其研究结果表明使用托西珠单抗阻断IL6/JAK2/STAT3通路抑制M2小胶质细胞活化可降低NSCLC患者BM发生率。
研究背景
关于BM机制研究的重点是转移的初始阶段，研究得最广泛的过程是上皮-间质转化（EMT）[5]。在EMT过程中，上皮细胞转变为间质干细胞，其转移能力大大增加，使肿瘤细胞在远处转移部位定植。一旦肿瘤细胞到达远处的器官，EMT发生逆转，称为间质到上皮的转变（MET）[6,7]。此前的研究[8,9]已证实MET在乳腺癌和结直肠癌转移中存在，但其在NSCLC 在大脑的定植过程中的表现仍不清楚。
小胶质细胞是大脑微环境中不可或缺的组成部分，参与先天免疫过程。作为组织特异性巨噬细胞，小胶质细胞表现出巨噬细胞特征。目前普遍认为巨噬细胞有两种不同的激活状态，即经典的促炎性M1状态（有iNOS和CD86标记）和抗炎性M2状态（有CD206和Arg1标记）[10,11]。M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM) 已被证明在肿瘤进展和转移中发挥关键作用。Watabe等人的研究表明M2小胶质细胞抑制局部免疫并促进乳腺癌细胞在大脑中定植。
鉴于小胶质细胞在各种微环境因素的刺激下表现出功能可塑性，该研究探究了转移性 NSCLC 细胞在大脑定植过程中肿瘤细胞和小胶质细胞之间的通讯，旨在揭示NSCLC-BM的分子机制，并提供新的治疗策略以改善患者的预后。
方法与结果
BM微环境中小胶质细胞表型的改变
为了探索小胶质细胞在 NSCLC 脑转移中的作用，研究评估了几种常用的具有野生型 EGFR（A549、H460、H292 和 H1299）的 NSCLC 细胞系的转移能力（图 1a、b）。 其中，A549细胞表现出最高的侵袭和迁移能力，被选作建立脑转移模型。Iba-1免疫组化染色分析提示在脑转移病灶中表现出丰富的小胶质细胞形态改变和树枝状增强（图1c）。 一致的是，人类NSCLC-BM标本的Iba-1免疫组化染色显示BM病变旁浸润活化的小胶质细胞（图1d）。
为了研究 NSCLC 细胞-小胶质细胞的相互作用，使用A549 细胞 (ACM) 的条件培养基 (CM) 刺激小胶质细胞，发现在培养24小时和48小时后，小胶质细胞分叉的形态变成了灌木状（图1e）。为了阐明ACM对特定小胶质细胞激活的影响，研究通过qRT-PCR分析了促炎症M1标志物（iNOS和CD86）和抗炎症M2标志物（CD206和ARG1）的表达。iNOS和CD86的表达在12 h时上调（P < 0.05），而CD206和Arg1的表达水平在24 h和48 h时升高（P < 0.05）（图1f）。Western blot分析显示，HMO6细胞中的iNOS和CD206水平在0h时几乎检测不到，表明小胶质细胞的静止状态（图1g）。免疫荧光分析显示，CD206+小胶质细胞在ACM处理24小时和48小时后明显增加（P < 0.05）（补充图S1a, b）。所有结果都一致地反映在 NSCLC-BM患者的标本中，CD206+小胶质细胞明显多于iNOS+小胶质细胞。
图1. NSCLC A549细胞改变小胶质细胞的表型
抗炎小胶质细胞的CM促进NSCLC细胞定植
为探索交替激活的小胶质细胞是否能逆转原发肿瘤内发生的EMT。实验通过TGF-β1处理触发了A549和H292细胞的EMT，并通过免疫荧光分析探讨了共培养CM（共HCM和共CCM）对间质A549和H292细胞的影响。TGF-β1减少了E-cadherin的表达，并上调了vimentin的表达，而共培养CM（共HCM和共CCM）可以逆转这一过程（图2a，b）。qRT-PCR和Western blot分析结果进一步验证共培养的CM可以诱导间质样A549细胞（图2c，e）和H292细胞（图2d，f）的MET，伴随E-cadherin上调和Vimentin下调。这些结果表明，抗炎小胶质细胞足以重新编程癌细胞，使其经过MET获得上皮表型并促进在大脑中的转移定植。
图2. M2-小胶质细胞CM促进NSCLC细胞定植
通过生物发光成像（BLI）以及苏木精和伊红染色对脑转移病灶切片的组织学分析，确认荧光素转导的A549（Luc-A549）细胞的转移活性。BM的发生率从F0的10.0%，分别增加到F1的28.6%和F2的50.0%（图3b）。结果证实，与母体细胞相比，转移性A549-F3细胞具有更强的侵袭和转移能力。
通过单细胞RNA-seq对小胶质细胞进行分类，并使用指数排序策略分析转移组和健康组大脑中细胞集群的差异（图3c）。在不同的细胞类型中表征了20个细胞集群（集群0-19）（图3d）。大多数细胞簇在A549和A549-F3细胞的转移病灶之间重叠（补充图S3b；图3e、f）。根据典型细胞标志物，进一步分析了不同组的活化抗炎小胶质细胞。结果显示，在A549和A549-F3组中，特征性的抗炎小胶质细胞是最主要的亚组，而在对照组中，抗炎和促炎小胶质细胞显示出类似的数量，维持平衡状态（图3g）。应用KEGG途径分析脑转移瘤中小胶质细胞的重叠集群，结果显示JAK/STAT途径和其他几个途径都明显上调（图3h）。已知JAK/STAT途径的上调参与了TAM的激活。基于上述结果，证实了体内NSCLC-BM中M2小胶质细胞的存在。
图3. 单细胞RNA-Seq揭示转移病灶中活化的小胶质细胞
IL6：BM中A549-F3和M2小胶质细胞通讯的介质
通过比较转录组学分析，比较高度转移的A549-F3细胞和A549-F0细胞以及与HMO6共培养的小胶质细胞与亲本A549细胞的全基因组表达谱。结果显示，BM衍生的A549-F3细胞中有4857个差异表达基因（DEGs），而共培养的A549细胞中有1769个DEGs（图4a，b）。根据标准化的数据与两套基因芯片进行了相关分析，得到了文氏图（图4c）。排名前30位的DEGs被进一步分析（图4d）。使用KEGG途径和基因本体论（GO）富集分析对表达趋势一致的重叠基因进行分析。IL6是A549-F3和共培养细胞中最突出上调的细胞因子（图4e）。qRT-PCR和WB的结果证实IL6在A549-F3和共培养的A549细胞中的表达升高（图4f，g）。此外，ELISA显示，与A549相比，A549-F3细胞介质中的IL6水平更高（图4h）。A549-F3/mock和IL6/knockdown小鼠实验亦证实，敲除IL6导致BM的发生率从58.3%下降到38.5%，并且转移病灶的光子通量减弱（图4j，k）。这些结果表明IL6在A549-F3 BM中的重要性，并表明IL6一定程度上参与相关信号传导。
图4. IL6是骨髓中A549-F3和M2小胶质细胞通讯的介质
IL6/JAK2/STAT3信号介导小胶质细胞的M2极化
IL6已被证明可激活JAK/STAT信号通路，鉴于A549-F3和共同培养的细胞表现出上调的IL6，研究推测IL6/JAK/STAT信号可能参与小胶质细胞的M2极化。在HMO6和CHME5细胞的培养液中加入不同浓度的重组人IL6（补充图S4a）。WB分析显示，IL6具有与F3-CM相同的效果，明显上调M2标志物（CD206和Arg1）。在F3-CM或补充IL6的培养基中加入不同浓度的托西珠单抗后，HMO6和CHME5细胞中CD206和Arg1的表达水平下降（图5a）。HMO6或CHME5细胞可以通过添加IL6或F3-CM进行刺激，而磷酸化的JAK2和STAT3的水平在托西珠单抗处理的条件下都会降低（图5b和补充图S4c）。菲德替尼抑制试验提示在有IL6或F3-CM的情况下，JAK2/STAT3被抑制，Arg1的表达水平也相应地被下调（图5c）。结果表明，F3-CM诱导的M2极化需要激活IL6/JAK2/STAT3信号传导。ChIP-PCR分析结果提示ARG1可能是STAT3的一个潜在靶基因，介导IL6诱导的M2极化。
图5.IL6/JAK2/STAT3信号介导小胶质细胞M2极化
靶向 IL6/JAK2/STAT3 信号传导抑制体内 A549-F3 转移
为了探究抑制IL6能否抑制小胶质细胞中JAK2/STAT3信号的活性，进而减少A549-F3体内脑转移的问题。四组BM活体成像显示，托西珠单抗治疗组（5mg/kg, 1次/周）的BM发病率为38.5%（5/13），而对照组(PBS)为70.0%（7/10），联合治疗组(PLX5622：1200mg/kg+托西珠单抗：同前)的BM发病率更高（50.0%，5/10）（图6a，b）。一致的是，转移灶的总BLI信号强度在单独使用托西珠单抗治疗的组中最低（图6c）。这表明，当小胶质细胞被PLX5622耗尽时，托西珠单抗对减少BM发病率的作用被明显抑制。将其他小鼠随机分为两组建立BM，治疗组接受菲德拉替尼 (100 mg/kg)，对照组接受玉米油灌胃，每两天一次（补充图S5b）。在结点，治疗组的BM负载明显低于对照组（45.5%/70%），同时转移灶的荧光反应也较低（P<0.05；图6d-f）。同时，脑转移组的血清IL6比没有BM的小鼠高（补充图S5d）。
此外，脑转移病灶的组织免疫组织化学（IHC）分析结果显示，p-STAT3和Arg1主要在脑基质表达，在转移病灶中表达较弱。总之，这些结果表明，IL6抑制剂（托西珠单抗或菲德替尼）可以阻断JAK2/STAT3的激活，阻碍体内A549-F3细胞的脑转移。
血清中较高的IL6水平与BM的高风险和不良预后有关
收集120名无BM的NSCLC患者的外周血样, 按IL6水平分为两组（n =120）。随访28个月后，对两组患者的BM差异进行分析。结果提示，IL6水平较高的一组有较高的脑转移风险（35% vs 17%，P = 0.012）（图6g）。TCGA数据显示，IL6水平低的NSCLC患者（n =318，中位生存时间=21.87个月），比IL6水平高的患者（n = 314，中位生存时间=26.33个月，P = 0.0006）总生存期更长（图 6h）。进一步的实验表明，NSCLC患者的脑转移组织中IL6和p-STAT3的表达远远高于没有转移的患者。总而言之，这些研究结果表明IL6在体内促进NSCLC脑转移，并可能作为NSCLC患者BM的一个预测性生物标志物。
图6. 靶向 IL6/JAK2/STAT3 信号传导抑制体内 A549-F3 转移
作为大脑免疫微环境的重要组成部分，小胶质细胞具有巨噬细胞的特征，可以影响脑转移的发展。然而，仍然缺乏直接证据阐明小胶质细胞和癌细胞在NSCLC脑转移过程中的相互作用。此研究发现在小鼠或NSCLC患者的脑转移中，小胶质细胞以M2表型为主。在体外，A549-F3细胞可使小胶质细胞极化为M2表型，反过来，由转移细胞激活的M2小胶质细胞促进间质癌细胞的MET，这对转移细胞在大脑中定植至关重要。
此前，几乎没有证据表明IL6水平与NSCLC患者脑转移的发生和发展有关。该研究分析了不同血清IL6水平的NSCLC患者的脑转移发生率，结果提示血清IL6水平具有预测NSCLC患者脑转移的潜力，为筛查NSCLC患者脑转移的高风险提供了新的预测指标。此外，研究首次表明抑制剂（托西珠单抗和菲德替尼）可以通过靶向小胶质细胞来干扰NSCLC-BM发生，预防性使用托西珠单抗有可能降低高危NSCLC患者的BM发生率。
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