虽然PARP抑制剂是极有效也极具广泛应用前景的肿瘤治疗策略，但出现耐药却不可避免，明确PARP抑制剂的作用机制和耐药机制，并有针对性的克服耐药是人们一直关注的重点。这篇综述总结了PARP抑制剂耐药的多种机制，并讨论了可用于克服或延迟耐药的方法。（文章内容丰富，值得细看哦！）
引言
靶向杀死癌细胞却不影响周围非恶性组织是目前治疗的主要目标。2005年，二项具有里程碑意义的研究表明，抑制多聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）活性对BRCA1或BRCA2缺陷细胞具有特异性的细胞毒性作用，这说明PARP1和BRCA1/2对DNA损伤修复至关重要。
PARP1是一种核酶，通过PARylation（即Poly-ADP-ribosylation，多聚[ADP-核糖]聚合）调节多种细胞过程，包括DNA损伤信号、染色质重构、转录、稳定复制叉、感应复制过程中未连接的Okazaki片段、炎症和代谢。PARP1对于及时准确修复DNA损伤至关重要，DNA损伤时PARP1迅速招募至单链断裂（SSBs）和双链断裂（DSBs）处，通过与单链DNA（ssDNA）结合实现自身和其他蛋白聚合，完成招募下游DNA修复因子。
BRCA1和BRCA2被招募后，对同源重组（HR）进行调节（S期和G2期有二个重要的DSBs修复途径，HR是其中之一），与其他DSBs修复途径不同，HR修复最大程度无错。BRCA1通过促进DSBs末端切除启动HR，然后与BRCA2和PALB2共同作用于下游，刺激RAD51聚集至切除的单链DNA处，这样HR可以使用新复制的姐妹染色单体作为模板精确修复DNA损伤。
除了在HR中的作用，BRCA1和BRCA2在S期也很重要，可以保护停止的复制叉不被核酸酶（如MRE11）降解。鉴于BRCA1和BRCA2的上述作用，任一基因的杂合胚系突变都会增加乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌的发生，源于剩余野生等位基因的丢失以及HR缺陷导致的高水平基因组不稳定性。HR缺陷的BRCA1/2突变肿瘤依赖代偿性DNA修复途径，药物抑制这些途径的关键成分（如PARP1）可致DNA损伤，在缺少BRCA1/2情况下引发关键基因组不稳定、有丝分裂灾难和细胞死亡，最终BRCA1/2和PARP导致协同致死。BRCA1/2缺陷肿瘤通常对DNA损伤因素很敏感，包括含铂化疗、拓扑异构酶（TOP）抑制剂和烷化剂，这些药物可能会产生导致BRCA1/2缺陷细胞致命的DNA损伤。
BRCA1/2和PARP1之间的相互作用是迄今研究最多的协同致死关系，PARP酶的小分子抑制剂得以迅速开发并用于临床。已有几个靶向酶促中心的PARP抑制剂获批多种适应症，目前有很多研究正在尝试进一步扩大其应用。
靶向PARP治疗肿瘤
1. 作用机制
目前有4种小分子PARP抑制剂（奥拉帕利、rucaparib、niraparib和 talazoparib）获批用于临床，还有3种正在进行III期研究（veliparib、pamiparib和fluzoparib）。PARP抑制剂通过阻止SSBs修复发挥作用，因为S期SSBs累积会影响复制叉进展，但PARP1基因缺失或受抑不影响细胞内的SSBs数量。此外XRCC1（碱基切除修复过程中与PARP1相互作用）缺失与BRCA2缺陷并无协同致死作用。因此假说认为，PARP抑制剂的抗肿瘤作用可能是滞留PARP1于DNA损伤处，形成DNA-蛋白交联，当复制叉与滞留的PARP1相遇时，交联触发复制叉崩溃，导致细胞S期DSBs累积；HR缺陷肿瘤细胞无法依赖BRCA1/2介导的无错方式修复DSBs，因此PARP抑制剂可诱导这些细胞发生致死性的DNA损伤（图1）。
图1 PARP抑制剂作用机制
大量研究支持PARP1滞留假说。首先，需要功能性PARylation释放DNA中的PARP1，表明确实形成滞留的DNA-PARP复合物；第二，各种PARP抑制剂具有不同的细胞毒性，相似的抑制PARP1催化活性能力，有研究显示这些PARP抑制剂滞留PARP1于DNA的相对能力与细胞毒性存在相关性，滞留能力最强的PARP1抑制剂是talazoparib，是niraparib的100倍，而niraparib又强于奥拉帕利和rucaparib。Veliparib的PARP1滞留能力似乎有限（尽管它能抑制PARylation），临床前模型中产生的协同致死水平低于其他PARP1抑制剂。除了滞留PARP1能力有所不同，PARP抑制剂还具有不同的异构效应。Talazoparib和奥拉帕利阻止PARP1从DNA释放，而rucaparib、niraparib和则是促进释放，这可能解释了体外药效的差异。因此，PARP抑制剂的最大耐受剂量随着PARP滞留水平的增加而降低，临床中更有效的PARP滞留剂通常必须使用更低剂量，但主要不良反应（恶心、呕吐、疲劳和贫血）有很大重叠。
研究表明，PARP抑制剂对细胞过程的影响可能较预期更多，如PARP抑制剂诱导DNA-蛋白交联不仅发生于DNA损伤中，也发生于DNA复制过程中的单链DNA和基因组内的核糖核苷酸。携带着S期PARP抑制剂诱导的损伤的细胞进入有丝分裂后，多发生有丝分裂缺陷，如染色质桥和滞后染色体，这些缺陷最终导致细胞死亡。一项2018年的研究表明，高剂量PARP抑制剂促进复制叉延长，降低DNA聚合酶保真度，增加DNA损伤反应激活。需要更多研究理解这些新的机制如何增加PARP抑制剂的细胞毒性作用以及是否依赖BRCA1/2缺陷。目前认为PARP抑制剂作用于多种DNA底物和过程，提示PARP抑制剂也可能降低BRCA1/2野生细胞及其他DNA修复缺陷细胞的生存，这是目前在非乳腺和卵巢的HR缺陷肿瘤中检测PARP抑制剂作用的原因。
2. 临床已批准的PARP抑制剂
2014年第一个PARP抑制剂奥拉帕利获批治疗≥三线化疗的BRCA1/2突变转移性卵巢癌及含铂化疗后完全或部分缓解BRCA1/2突变卵巢癌的维持治疗。2016年第二个PARP抑制剂rucaparib获批治疗≥二线化疗的BRCA1/2突变晚期卵巢癌。2019年niraparib获批治疗≥三线化疗的HR缺陷晚期卵巢癌。
2014年一项回顾性分析显示，BRCA1/2野生卵巢癌奥拉帕利维持治疗有无进展生存（PFS）获益，奥拉帕利因此获批该适应症。III期研究证实，奥拉帕利、niraparib或rucaparib均能显著改善突变或野生BRCA1/2卵巢癌的PFS。三个PARP抑制剂因此均获批复发卵巢癌的维持治疗，无论BRCA1/2突变状态。这表明部分BRCA1/2功能正常患者可能存在临床相关的HR缺陷，可能与其他HR相关基因突变（如RAD51）或其他机制相关。
2018年公布的III期研究表明，奥拉帕利维持治疗为新诊断的BRCA1/2突变晚期卵巢癌带来显著的PFS获益，与安慰剂相比，疾病进展或死亡风险降低70%。这使得奥拉帕利获批BRCA1/2突变晚期卵巢癌的一线维持治疗。2020年niraparib获批晚期铂敏感卵巢癌的一线维持治疗，无论BRCA1/2状态。
2018年奥拉帕利首个获批治疗既往接受过化疗的HER2阴性BRCA1/2突变转移性乳腺癌，不久talazoparib也获批类似适应症。2019年奥拉帕利首个获批维持治疗BRCA1/2突变转移性胰腺癌。2020年奥拉帕利获批治疗恩杂鲁胺或阿比特龙治疗后进展的HR相关基因突变的转移性去势耐药前列腺癌，这是首次批准奥拉帕利治疗BRCA1/2以外基因突变肿瘤。奥拉帕利对这类肿瘤的疗效如何仍不清楚，因为PFS分析时包括的亚组只需15个DNA修复基因中任一基因有改变即可，其中还包括BRCA1和BRCA2，这使得明确单个基因突变如何影响PFS获益极具挑战性。与BRCA1/2突变相比，ATM和其他DNA损伤反应（DDR）基因突变患者奥拉帕利治疗的PFS获益很少。继奥拉帕利之后，rucaparib获加速批准治疗BRCA1/2突变转移性去势耐药前列腺癌，患者既往接受过靶向雄激素受体治疗及含紫杉类的化疗。
Veliparib尚未获批，研究中它主要是与化疗或靶向治疗联合治疗多种实体瘤，可能源于其较低的滞留PARP1能力、有限的协同致死能力和单药活性。近几年还开发了pamiparib和fluzoparib，二者是否优于已批准药物仍有待确定。Pamiparib的I期研究显示其具有良好的安全性和初步抗肿瘤活性，进而启动了III期研究比较pamiparib与安慰剂维持治疗铂敏感晚期卵巢癌。一项II期研究正在探索pamiparib治疗既往一线含铂化疗有效的局部晚期或转移性胃癌的疗效。
尽管临床前数据表明fluzoparib的安全性良好，体内抗肿瘤活性与奥拉帕利相似，但其临床数据仍很有限。III期研究正在评估fluzoparib维持治疗铂敏感复发卵巢癌、BRCA1/2或PALB2突变胰腺癌（一线含铂化疗未进展者）的疗效。
PFS是目前PARP抑制剂研究中广泛使用的主要终点，总生存（OS）数据很有限，只有奥拉帕利公布了治疗HER2阴性乳腺癌和晚期胰腺癌的OS数据，显示奥拉帕利的OS在数值上更优，但并无统计学差异，由于OS不是研究的主要终点，比较可能效力不足。一项II期研究的OS分析显示，复发铂敏感晚期BRCA突变卵巢癌在含铂化疗后奥拉帕利单药维持治疗，PFS和OS均改善，但OS获益（29.8个月和27.8个月）不具统计学意义。2020年11月SOLO1研究的新数据显示，与安慰剂相比，奥拉帕利维持治疗新诊断的铂敏感晚期BRCA1/2突变卵巢癌，可延长中位PFS 42个月，令人惊讶的是基线完全缓解患者的疾病复发或死亡风险降低63%。虽然OS数据仍需等待，但PFS的大幅增加似乎有可能转化为OS改善。2021年3月III期SOLO2研究预设的OS分析显示，与安慰剂相比，奥拉帕利维持治疗可使复发铂敏感晚期BRCA1/2突变卵巢癌的中位OS延长12.9个月，这是首个PARP抑制剂维持治疗改善OS的报告。对于其他PARP抑制剂和铂敏感的BRCA1/2突变卵巢癌以外的肿瘤，OS获益仍有待确定。总之数据表明，PARP抑制剂可以延迟疾病复发，某些情况下可延长OS，多数患者最终疾病仍会进展，因此有必要更好的理解药物的耐药机制，延迟或克服这种影响。
3. BRCA1/2之外的突变
胚系和/或体细胞BRCA1/2突变患者PARP抑制剂获益似乎最大，但数据表明，缺乏这些突变的患者也能从PARP抑制剂治疗获益，只是获益较小。一项III期研究发现，含铂化疗有效的复发卵巢癌rucaparib维持治疗，BRCA1/2缺陷卵巢癌中位PFS从5.4个月增加至16.6个月，BRCA1/2野生HR缺陷患者为13.6个月，整个队列为10.8个月，后二者也具统计学意义。其他几项研究报告BRCA1/2野生卵巢癌的PFS也有统计学意义的改善 ，因此2020年4月niraparib获FDA批准维持治疗晚期卵巢癌，无论HR状态。
这些数据表明，BRCA1/2突变并不能完全解释PARP抑制剂获益。临床前数据早已表明，其他HR基因缺陷也可能导致PARP抑制剂敏感。包括卵巢癌和前列腺癌的几项研究表明，BRCA1/2野生但携带其他DNA修复基因有害突变的肿瘤，如PALB2、各种RAD51同源基因、ATM、CHEK2、CDK12、FANCA、RAD54L和BRIP1，也可能获益于PARP抑制剂治疗。越来越多研究表明，PALB2（HR过程中与BRCA1和BRCA2一起作用的因子）突变是提示PARP抑制剂敏感的指标，其他HR相关的核心基因突变，如RAD51，也可能赋予PARP抑制剂敏感性。其他DDR相关基因（如ATM和CHEK2）突变是否导致PARP抑制剂敏感尚不清楚，目前正在研究中。
除了关键的DNA修复因子外，染色质调节因子突变，如ARID1A和BAP1，也是体外PARP抑制剂敏感性增加的原因。临床前模型显示，由于参与Krebs循环的基因突变（如IDH1/2、FH和琥珀酸脱氢酶），间接下调HR相关蛋白，从而增加PARP抑制剂的敏感性。值得注意的是，一些缺乏HR相关基因突变的癌症（如小细胞肺癌）对PARP抑制剂也表现出一定敏感性，可能源于RB1突变引起的复制应激增加。因此在关注BRCA1/2突变和HR修复缺陷的基础上，建立PARP抑制剂在更多类型癌症中应用的理论基础至关重要，现已开发几种识别非BRCA1/2突变相关的HR缺陷肿瘤的诊断工具，如确定RAD51状态的分析、评估与HR缺陷相关的突变特征和基因组不稳定性，均可能有助于识别PARP抑制剂获益患者，其中区分PARP滞留的一般效应和肿瘤对PARP抑制剂的特异敏感性至关重要。
PARP抑制剂的耐药机制
PARP抑制剂的初始治疗反应通常良好，但多数患者最终会发生耐药、疾病复发。PARP抑制剂获得性耐药主要有三种机制：药物靶点相关效应，如药物流出泵上调、PARP或相关功能蛋白突变；BRCA1/2功能恢复使得HR恢复；DNA末端保护缺失和/或复制叉稳定性恢复（图2）。
图2 PARP抑制剂的耐药机制
1. 药物流出泵上调
药物流出转运蛋白ABCB1（也称为P-糖蛋白）上调，是最早提出的导致PARP抑制剂耐药的机制之一。ABCB1属于ATP-binding cassette（ABC）转运蛋白家族，通过阻止细胞内药物积聚发挥作用，是多种化疗药物和其他药物耐药的原因。最初在自发发生乳腺肿瘤的BRCA1/2缺陷小鼠模型中观察到ABCB1诱导的PARP抑制剂耐药，这些模型长期暴露于奥拉帕利，导致耐药的ABCB1过表达肿瘤生长，奥拉帕利和ABCB1抑制剂tariquidar联合应用可逆转耐药，证明药物流出增加确实是耐药的原因。尽管该机制的临床意义尚不清楚，但有报道显示ABCB1在化疗耐药卵巢癌中上调。虽然所有PARP抑制剂均抑制相同的靶域，但veliparib和niraparib是ABCB1的不良底物，因此二者有可能绕过ABCB1诱导的耐药。此外ABCB1过表达常引起紫杉类和阿霉素等化疗药物的交叉耐药，因此不经ABCB1转运的PARP抑制剂可能对既往接受过化疗的患者更有效。
2. 与靶向相关的耐药机制
目前的PARP抑制剂都是通过与辅因子NAD+竞争靶向PARP酶催化域，因此降低PARP抑制剂亲和力的PARP1突变或是与PARP抑制剂结合时仍能保留内源性酶功能的PARP1突变均可导致耐药。体外研究表明，与PARP抑制剂耐药相关的点突变不仅存在于酶催化位点，也存在于将PARP1滞留于DNA所需的结构域。有证据显示，在ARP抑制剂耐药卵巢肿瘤中发现一种PARP1突变，不影响PARP1招募至DNA损伤部位，却能阻止PARP1有效滞留。由于PARP1和BRCA1功能联合缺失才能产生协同致死，因此PARP1突变只能使HR正常细胞或具有亚效BRCA1等位基因突变细胞以及具有BRCA1活性残留的细胞产生耐药性。
多聚（ADP-核糖）糖化酶（PARG）可从目标蛋白中移除PAR链，是体内外PARP抑制剂耐药的另一关键因素，如由于PARG缺失，导致发生BRCA1/2缺陷乳腺肿瘤的基因工程小鼠模型PARP抑制剂耐药。有趣的是，这些模型的细胞暴露于PARP抑制时，PARG缺失能部分挽救PARylation水平，表明PARP1抑制只是减少而不是完全抑制PARylation，暴露于PARP抑制剂的PARG缺陷细胞能够保留足够的靶蛋白PARylation诱导DNA损伤信号级联，也能减少因残留的PARP活性所致的PARP1滞留于DNA。临床证据仍然有限，二项小型研究显示，大比例的适合PARP抑制剂治疗的三阴性乳腺癌（TNBC）（76.8%）和卵巢癌（78.4%）的PARG阴性区域≥10%。
3. BRCA1/2功能恢复
临床已证明的PARP抑制剂耐药机制是通过逆转突变或表观遗传改变，导致BRCA1或BRCA2野生蛋白再表达或发生亚效等位基因突变。导致蛋白截断的BRCA1/2突变逆转最初见于BRCA2突变卵巢癌和胰腺癌细胞株长期暴露于PARP抑制剂或顺铂，BRCA1/2缺陷细胞具有高水平的基因组不稳定性，顺铂和PARP抑制剂可加重这种不稳定性，细胞进一步积累遗传学改变，最终导致新的BRCA2异构体的重新表达。与预期的耐药机制一致，表型逆转细胞又能够招募RAD51至DNA损伤部位，降低基因组不稳定性水平。BRCA1突变和BRCA1甲基化TNBC的异种移植（PDX）模型显示，PARP抑制剂的获得性耐药源自缺失突变导致的BRCA1突变阅读框恢复、BRCA1基因启动子甲基化缺失或是新发融合使得表观遗传沉默的BRCA1重新表达。BRCA1甲基化卵巢癌的PDX模型显示，只有所有BRCA1拷贝甲基化才与PARP抑制剂有效相关，杂合甲基化与耐药相关。与这些临床前发现一致，BRCA1完全甲基化能预测PARP抑制剂的临床疗效，既往化疗可诱导甲基化缺失。
几项研究报道了BRCA1/2基因逆转导致的PARP抑制剂耐药，包括乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。2020年7月发表了一项对HR相关基因逆转导致PARP抑制剂或含铂化疗耐药的分析，显示多数逆转单独存在，但BRCA2编码序列中存几个逆转热点，表明这些位置突变更易发生导致PARP抑制剂耐药的逆转。重要的是，与PARP抑制剂耐药相关的逆转并不只发生于BRCA1/2，也可发生于其他HR相关基因，如RAD51C、RAD51D和PALB2。含铂化疗或PARP抑制剂治疗期间的逆转突变表明，BRCA1/2或其他HR相关蛋白功能缺失引起的基因组不稳定性仅在肿瘤发生时为必需，肿瘤维持过程中则非必需。因此，由逆转突变引起的治疗耐药成为“肿瘤抑制耐受”的范例，即癌症初发阶段的突变的功能恢复，能增加肿瘤的适应能力。
由于PARP抑制剂用于临床只有几年，而且逆转突变检测非常复杂，因此目前缺少由大规模研究得出的PARP抑制剂耐药肿瘤中BRCA1/2再激活频度数据。PARP抑制剂最初获批一线含铂化疗后的二线维持治疗，这可能使研究结果产生偏差，因为BRCA1/2再激活也是BRCA1/2突变肿瘤铂耐药的主要机制。未来研究应纳入PARP抑制剂一线治疗患者，有助于更好地理解铂类药物和PARP抑制剂耐药的共同机制，因其可导致二类治疗的交叉耐药。
4. 非BRCA1依赖的HR恢复
除了BRCA1和BRCA2逆转，还存在其他耐药机制导致的PARP抑制剂耐药。临床前研究表明，代偿性突变也可恢复HR，导致DDR重新发挥作用（图3）。三项里程碑式研究表明，非同源末端连接（NHEJ）因子53BP1缺失部分抵消了BRCA1缺陷对HR和基因组不稳定性的影响；敲除小鼠Tp53bp1可以挽救胚胎致死、减少肿瘤形成和BRCA1缺陷引起的染色体不稳定性。体外研究表明，53BP1缺失可恢复BRCA1缺陷细胞的DNA末端切除，修复HR缺陷，导致细胞对PARP抑制剂耐药。重要的是，53BP1缺失不能恢复BRCA2缺陷细胞的HR，这与BRCA1和BRCA2在HR中的作用不同相关。后续研究鉴定了几个53BP1下游蛋白，如RIF1、REV7和shieldin复合物，均具有拮抗末端切除的作用，失活后使得BRCA1缺陷细胞和小鼠乳腺肿瘤对PARP抑制剂耐药。另有BRCA1缺陷乳腺癌小鼠模型表明，53BP1-RIF1-REV7-shieldin拮抗切除信号通路的缺失介导了PARP抑制剂耐药。小鼠长期暴露于PARP抑制剂导致获得性耐药，通常与新发突变、DNA拷贝数畸变以及Tp53bp1、Rev7、Rif1和Shld2表达缺失有关。PARP抑制剂获得性耐药的PDX模型也观察到53BP1和shieldin组分的缺失。有报道显示，含铂化疗或PARP抑制剂治疗的BRCA1相关乳腺癌患者存在非BRCA依赖的HR恢复（源于MRE11扩增或TP53BP1突变）所致的耐药。
图3.非BRCA1依赖的HR恢复
除了53BP1-RIF1-REV7-shieldin信号通路外，其他几个调节末端切除的因素也可能与耐药相关，只是临床数据有限。CTC1-STN1-TEN1（CST）复合物位于 53BP1-RIF1-REV7-shieldin下游，有研究显示该复合物可阻止DSBs末端切除，该复合物成分缺失导致非BRCA1依赖的末端切除恢复，诱导PARP抑制剂耐药。与53BP1-RIF1-REV7-shieldin信号通路相比，CST复合物缺失诱导PARP抑制剂耐药的作用似乎更轻微，表明存在其他机制保护DSBs不被末端切除。HELB和DYNLL1作用于53BP1下游，拮抗DNA末端切除机制中的多种成分，这些因子的缺失导致DNA末端过度切除，使得BRCA1缺陷肿瘤细胞对PARP抑制剂耐药。除了抑制末端切除因子外，DYNLL1可能通过刺激53BP1寡聚而促进NHEJ，从而促进招募并与DSBs结合。更上游的ERCC6L2（NHEJ辅助因子）缺失也可恢复DNA末端切除，导致BRCA1缺陷细胞的HR部分恢复和PARP抑制剂耐药。同样，促进HR和抑制NHEJ的因子过表达，如TIRR134、TRIP13和miRNA-622，也可恢复HR，降低BRCA1缺陷细胞对PARP抑制剂的敏感性。这些数据强化了这一概念，即PARP抑制剂耐药源自缺乏功能性BRCA1的细胞中DNA末端保护缺失。上述研究还表明，BRCA1在RAD51介导的HR下游步骤中并非完全必需，但BRCA2在该通路中却是至关重要。
5. 恢复复制叉稳定性
通过干扰53BP1及与末端切除和/或保护相关的下游因子恢复HR，只局限于BRCA1缺陷细胞，复制叉稳定性恢复引起的PARP抑制剂获得性耐药则是BRCA1或BRCA2缺陷细胞的共同机制。如前所述，BRCA1和BRCA2不仅参与HR，二者还参与控制复制叉的稳定性，在复制应激下具有保护作用。
MRE11和MUS81的核酸酶活性是进一步处理停止的复制叉所必需。BRCA1/2缺失情况下，MRE11不受控制地切除未受保护的复制叉会导致复制叉崩溃，从而增加基因组不稳定性。与之相符的是，MLL3/4复合蛋白PTIP或核小体重构因子CHD4缺失可阻止MRE11招募至复制叉，对BRCA1/2缺陷细胞的复制叉起到保护作用，导致PARP抑制剂耐药。染色质重塑复合物SMARCAL1也能促进BRCA1/2缺陷细胞新生DNA的MRE11依赖性降解。与PTIP缺失类似，SMARCAL1缺失降低了BRCA1缺陷肿瘤细胞对PARP抑制剂的敏感性，但这种作用似乎是细胞类型特异性的。
RADX是参与复制叉保护的另一个因子，BRCA2缺陷细胞中该因子的缺失也可恢复复制叉保护，减轻PARP抑制剂的细胞毒作用。通过抑制甲基转移酶EZH2限制MUS81招募也具有复制叉保护作用，导致PARP抑制剂部分耐药，特别是在BRCA2缺陷细胞。但MUS81作用的相关数据存在冲突。值得注意的是，PTIP、EZH2或RADX缺失不能削弱BRCA1/2缺陷细胞的HR功能，表明复制叉保护的恢复是PARP抑制剂耐药的关键。既往研究表明，复制叉保护的恢复取决于复制应激的来源、遗传背景和特定的复制叉结构，为了更好地理解复制叉的不稳定性并将其用于癌症治疗，这些均需予以考虑。
最后很重要的一点是，已知PARP1介导MRE11招募至停止的复制叉。在BRCA1/2缺陷细胞中，PARP1缺失可诱导协同致死，而PARP1下调能恢复停止的复制叉的稳定性并促进细胞生存，后者可能是通过限制MRE11在复制叉上的累积而实现。鉴于PARP1对复制叉的多种作用，需要进一步研究理解其如何影响PARP抑制剂的联合治疗结果。
Schlafen 11（SLFN11）是另一个与复制应激有关的因子。SLFN11是对癌细胞数据库的药物基因组分析时所确定，它是多种复制应激诱导剂（包括TOP1抑制剂、TOP2抑制剂、烷化剂、DNA合成抑制剂和PARP抑制剂）发挥作用的重要决定因素。研究表明，复制损伤时，SLFN11与复制解旋酶复合物结合，介导细胞发生不可逆的G1/S期阻滞。SLFN11与应激状态下的复制叉的结合，促进染色质松弛阻止细胞复制，最终导致细胞死亡。因此SLFN11缺失破坏了G1/S期阻滞，使得细胞在存在复制应激的情况下通过S期。与该效应一致的是，SLFN11缺失能降低PARP抑制剂对BRCA1/2正常和BRCA2缺陷细胞的细胞毒性作用。重要的是，HR在SLFN11正常和SLFN11缺陷细胞中都具有功能，表明该蛋白与HR同时发挥作用。
克服PARP抑制剂耐药的策略
1. 联合策略
抑制可替代的HR通路。BRCA1缺陷细胞存在HR缺陷，虽然因此存在动力学延迟，但DNA末端切除仍可发挥作用，表明BRCA1在HR中还有其他作用，确实BRCA1还能招募PALB2-BRCA2复合物至ssDNA，促进BRCA2介导的RAD51核蛋白丝的组装。研究显示，BRCA1缺陷细胞中，PALB2以RNF168依赖方式招募至ssDNA，表明BRCA1/53BP1双缺陷细胞中HR的再活化是通过依赖RNF168的PALB2招募和因53BP1-RIF1-REV7-shieldin缺失而增加的末端切除实现的。53BP1缺失所致的HR恢复，其程度取决于BRCA1突变类型，因为RAD51的整体效力（影响PARP抑制剂耐药的程度）可能因为存在亚效BRCA1等位基因突（保留了与PALB2相互作用的能力）而得以增强。与介导PALB2招募作用相符的是，RNF168缺失削弱了BRCA1杂合细胞和BRCA1/53BP1双缺陷细胞的HR，使得这些细胞对PARP抑制剂敏感。因此，靶向RNF168治疗可能对抑制非BRCA1依赖的PALB2/BRCA2招募有效，从而改善PARP抑制剂对获得性耐药（源于53BP1-RIF1-REV7-shieldin末端保护通路缺失）的BRCA1突变肿瘤的疗效。
DNA修复蛋白RAD52的作用越来越受到重视。最初的研究显示，RAD52缺失对体内外生存能力的影响很轻微，但后续研究显示，RAD52和BRCA1/2共同缺失可诱导协同致死，表明RAD52可能作为备份途径，使得RAD51能够在BRCA1/2缺失情况下进行DNA末端切除。证据还表明，RAD52可能在停止的复制叉的ssDNA修复中发挥作用，并介导复制叉逆转。因此协同致死可能是RAD52二种功能的综合效应，而不是一种功能的结果。RAD52抑制剂也已开发出来，并有望成为靶向BRCA缺陷肿瘤的替代方法。还需要更多研究确定RAD52抑制剂的体内疗效，目前证据显示，PARP抑制剂和RAD52抑制剂间具有协同作用，对BRCA-1缺陷细胞具有更强的细胞毒作用。
间接抑制HR。目前还没有催化HR蛋白的直接抑制剂可用。抑制HR的另一种策略是靶向其他具有活性的癌蛋白，干扰基因表达、核定位和/或HR蛋白招募，达到间接抑制HR的目标，如靶向EGFR、IGF1R、VEGF或PI3K-AKT通路可削弱HR。有证据显示，VEGF拮抗剂贝伐单抗联合奥拉帕利或niraparib与安慰剂或niraparib单药相比，包括HR正常的卵巢癌患者的中位PFS改善。AKT抑制剂capivasertib联合奥拉帕利的I期研究显示，无论BRCA1/2状态，晚期实体瘤患者均显示持久的疗效。另一正在进行的研究采用的是MEK抑制剂selumetinib联合奥拉帕利治疗。有研究认为，上述抑制剂的治疗活性可能源于影响细胞周期进展，而不是直接抑制HR，提示这些联合治疗的作用可能仅仅是叠加而非协同。
通过药物靶向表观遗传调节也能间接抑制HR。如溴结构域和末端外结构域（BET）蛋白BRD4通过RNA聚合酶II促进转录，而BET和/或BRD4抑制剂可抑制关键DDR基因的转录，包括CTIP、BRCA1、RAD51、TOPBP1和WEE1，导致临床前研究中HR和PARP抑制剂的协同作用被取消。同样，抑制组蛋白去乙酰化酶可下调HR，也可用于诱导PARP抑制剂的敏感性。抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs），如CDK1（磷酸化BRCA1促进HR修复）和CDK12（包括BRCA1在内的几个HR基因的转录调节因子），可有效抑制HR，诱导PARP抑制的敏感性。此外，热休克蛋白90（HSP90）可促进HR蛋白亚群的稳定性，包括RAD51、BRCA1和BRCA2，靶向抑制该蛋白可诱导HR缺陷，促进对PARP抑制剂的敏感性。最后，缺氧可诱导BRCA1的长期表观遗传沉默，因此诱导PARP抑制剂敏感。重要的是，上述方法均可用来提高肿瘤对PARP抑制剂的敏感性，HR恢复的肿瘤、BRCA活性减退或功能完全的肿瘤均可，但也可能对非恶性增殖细胞（如骨髓造血祖细胞）产生毒性作用。
取消细胞周期检查点信号。几项研究表明，取消细胞周期检查点信号可能减少PARP抑制剂的耐药性。ATM和ATR是二种控制细胞周期检查点激活的重要激酶，负责DNA损伤时的细胞捕获。BRCA1突变细胞中导致PARP抑制剂耐药的几个过程均依赖ATR，如非BRCA1依赖的HR和复制叉保护，ATR通过促进RAD51招募至DSBs和中止复制叉来控制这二个过程。因此PARP抑制剂和ATR抑制剂联合有可能通过恢复HR功能或复制叉保护而克服PARP抑制剂耐药。
已证实染色质重塑酶ARID1A通过与ATR相互作用调节DNA损伤检查点，ARID1A缺失减低细胞周期检查点激活，细胞对PARP抑制剂的敏感性增强。与ATR类似，ATM激酶活性为早期HR所必需，抑制ATM可使BRCA1和53BP1或BRCA1和REV7缺陷细胞对PARP抑制剂重新敏感。
临床前模型采用PARP抑制剂与WEE1激酶抑制剂联合治疗，WEE1激酶通过抑制CDK1和CDK2调控G2/M进程，激活G2/M细胞周期检查点，导致细胞周期阻滞，为DNA损伤修复提供时间。PARP和WEE1抑制剂联合旨在消除G2阻滞，诱导有丝分裂灾难。一项卵巢癌异种移植模型研究表明，序贯（非同时）抑制PARP和WEE1可提高联合药物的耐受性，同时仍保持抗肿瘤活性。
制药公司正在开发细胞周期检查点激酶（如ATR、ATM、CHK1和WEE1）的抑制剂，并在研究中评估与PARP抑制剂联合的抗肿瘤作用，能否用于临床取决于其对PARP抑制剂获得性耐药患者是否有效，同时不应对非恶性组织有过多的毒性作用。
靶向NAD+代谢。PARP1使用氧化的NAD（NAD+）作为PARylation底物，是细胞NAD+分解代谢的主要来源，DNA损伤后几分钟内，NAD+降至其非应激水平的10-20%。过度的PARP激活（通过氧化应激或过度DNA损伤）可耗尽细胞内的NAD+，导致ATP水平进行性下降、能量损失和细胞死亡。因此为了维持NAD+水平，细胞需依赖挽救性途径。功能性遗传筛查显示，烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT，NAD+挽救途径限速酶）缺失增强PARP抑制剂对TNBC细胞的细胞毒作用。体内研究显示，奥拉帕利联合NAMPT抑制剂FK866可有效抑制TNBC异种移植瘤，疗效优于二种抑制剂单独使用。异柠檬酸脱氢酶（IDH）的新发突变在胶质瘤中很常见，通过下调NAD+挽救途径的烟酸磷酸核糖转移酶（NAPRT1）降低NAD+水平，使得这些肿瘤对NAD+耗损异常敏感。此外突变IDH还会产生肿瘤代谢产物D-2-羟基戊二酸（D-2HG），该物质可抑制HR并诱导对PARP抑制剂的敏感性。因此，新发IDH1/2突变可能通过二种机制诱导PARP抑制剂的超敏感性。最后，NAD+的衍生物NADP+可作为内源性PARP抑制剂，通过竞争PARP的NAD+结合位点抑制PARylation。因此无论BRCA突变状态，高NADP+/NAD+的肿瘤细胞对PARP抑制的敏感性增加，这源自PARylation的减少而非将PARP滞留于DNA。
综上所述，PARP抑制剂的细胞毒作用可通过间接抑制PARylation而得到增强，间接抑制PARylation可由靶向抑制NAD+代谢实现。需要更多研究深入理解肿瘤代谢和HR修复（缺陷）间的相互作用，以及这些相互作用如何影响PARP抑制剂的疗效。这些认识可能会揭示PARP抑制剂下癌细胞的代谢弱点，通过靶向这些弱点可改善疗效。
BRCA缺陷肿瘤的免疫治疗。PARP抑制剂与免疫检查点抑制剂（如抗PD-1抗体）联合，是治疗BRCA1/2突变肿瘤的潜在方法，一些观察结果引发了对这一治疗的关注。首先，HR缺陷肿瘤的突变负荷增加，可能导致肿瘤特异性新抗原增加（包括大的基因组重排）；其次，HR缺陷可能导致未修复的DNA片段在细胞质中积累，激活环状GMP-AMP合成酶（cGAS），cGAS是干扰素基因（STING）信号通路的刺激因子，它对核外双链DNA的识别触发IRF3-I型干扰素信号通路激活，这一过程介导全身免疫反应，诱导激活几种类型的免疫细胞。BRCA1/2缺陷肿瘤的基因组重排还可能破坏染色质边界，导致重复RNA的表达，激活固有免疫信号；第三，PARP抑制可诱导PD-L1表达（通过失活GSK3β）和cGAS-STING信号通路，导致CD8+T细胞浸润增加和活化增加。PARP抑制剂介导的cGAS-STING信号通路激活是否依赖肿瘤的BRCA突变状态仍有争议，一项研究表明，无论BRCA突变状态，cGAS-STING信号通路都被激活，而另一些研究发现，该通路可单独激活，但在BRCA缺陷肿瘤中可更强烈的激活。
与上述相符的是，多项研究表明，小鼠乳腺癌和卵巢癌模型中，PARP抑制增强抗PD-1抗体的抗肿瘤作用。一些研究正在评估二者联合的治疗作用，但由于初步研究中仅纳入少量患者，因此一些有意义的结果尚不能作为一般性结论。卵巢癌或乳腺癌患者采用PARP抑制剂联合抗PD-1抗体治疗的耐受性通常良好，与单药治疗相比，似可提高客观缓解率。然而I/II期研究发现，铂耐药的BRCA1/2突变卵巢癌患者的客观缓解率与野生型患者相比并无显著差异。值得注意的是，不是所有入组患者都检测了BRCA1/2突变，也未评估其他HR基因突变状态。如上所述，免疫检查点抑制剂与PARP抑制剂的联合治疗仍是活跃的研究领域，PARP抑制剂获得性耐药患者是否可从该联合治疗获益还有待确定。
2.靶向获得性的易感性
耐药通常伴随着适应所带来的成本，即导致获得性易感性，理论上可以用作治疗靶点以提高后续治疗的疗效（图4）。几个功能缺失性突变导致的PARP抑制剂耐药可增加电离辐射的敏感性，如PARG失活。同样，53BP1-RIF1-REV7-shieldin或CST末端保护复合物以及PARP1缺失均可导致对电离辐射的超敏感。因此，对于因上述原因而对PARP抑制剂获得性耐药的BRCA缺陷肿瘤，放疗具有可行性。
除了对电离辐射敏感外，缺乏PARP1活性的细胞对TOP1抑制剂喜树碱的敏感性增加，这源于PARP1在修复TOP1切割位点中的作用。此外，PARG下调可导致NAD+的代谢消耗并增加PARP1滞留于染色质，使得细胞对烷化剂替莫唑胺敏感。
PARP抑制剂获得性耐药肿瘤除了对电离辐射、喜树碱或替莫唑胺的敏感性增加外，2020年提出的方法则可用于治疗因基因逆转而对PARP抑制剂获得性耐药的肿瘤。通常基因逆转不能恢复原始蛋白的完整氨基酸序列，因此多数逆转蛋白都包含氨基酸的延展（多位于逆转接合处），这种改变在野生基因编码的蛋白中并不存在，因此可能以新抗原形式表达于细胞表面，并被免疫系统识别。此种情况下可以使用癌症疫苗、嵌合抗原受体T细胞和/或免疫检查点抑制剂治疗。
图4.靶向PARP抑制剂耐药肿瘤的获得性易感性
3.阻止耐药的出现
靶向对药物耐受的细胞。PARP抑制剂主要在S和G2期特异性地引起DNA损伤，因此对增殖期的细胞具有特异性的作用，而G0或G1早期细胞可能不受PARP抑制剂的影响，因为HR和复制叉在这些阶段均不活跃。事实上，持续暴露于PARP抑制剂能诱导卵巢癌细胞系衰老，停用PARP抑制剂后衰老可逆转，表明持续保持衰老状态的细胞可能有助于肿瘤的进一步生长。有些过程，如表观遗传重编程、转录调控以及与肿瘤微环境的相互作用，可能会延迟细胞增殖，从而使细胞对治疗的反应性降低。对药物耐受的肿瘤细胞的持续存在为长期维持治疗提供了理论基础，维持治疗有可能杀死进入细胞周期的残留休眠细胞。
抑制突变表型。为了修复HR缺陷情况下的DNA DSBs，BRCA1/2缺陷细胞能够上调微同源介导的末端连接（MMEJ）作为一种补偿机制，该机制在HR正常细胞中的作用很小。MMEJ修复途径易出错，因其由低保真度DNA聚合酶θ（POLQ）驱动。POLQ可将二条具有短（>2bp）的同源序列的断裂DNA链连接起来，全基因组测序可在BRCA1/2缺陷肿瘤中检测到这种MMEJ特征性的突变模式。鉴于HR缺陷肿瘤中DSBs的修复依赖POLQ介导的MMEJ，因此抑制该途径有可能成为一种新的治疗，已有二个研究小组报道了POLQ缺失与HR相关蛋白的相互作用可导致协同致死。值得注意的是，抑制POLQ可抑制MMEJ引起的基因组不稳定性，因此这种方法可能优于抑制PARP，后者会增加基因组不稳定性，加速出现“突变表型”HR缺陷肿瘤。因此POLQ抑制可能不仅对PARP抑制剂获得性耐药肿瘤有效，而且可能会阻止或削弱未曾暴露于PARP抑制剂的HR缺陷肿瘤出现治疗后耐药。
POLQ抑制剂的发展引发广泛关注。据报道抗生素novobiocin（NVB）具有抑制POLQ ATP酶活性的作用。与此一致的是，NVB对POLQ的抑制可在体内体外选择性地杀死HR缺陷肿瘤。此外在BRCA1和53BP1功能联合缺失的PDX模型中，NVB能降低肿瘤生长，表明POLQ抑制对DNA末端保护缺失所致的PARP抑制剂获得性耐药肿瘤是可行选择。
还需要进一步研究来回答几个关键问题，它们决定了POLQ抑制剂能否用于临床：
（1）POLQ抑制剂是单药即有效还是需与PARP抑制剂联合才有效；
（2）POLQ抑制剂是否对所有PARP抑制剂耐药肿瘤都有效，还是只对某些机制（如DNA末端保护缺失）所致的耐药肿瘤才有效；
（3）基因组不稳定或BRCA1/2之外的HR相关基因突变肿瘤是否对POLQ抑制剂敏感仍有待确定。
PARP抑制剂研究的发展方向
临床前和临床研究显著提高了对PARP抑制剂作用机制和可能耐药机制的认识。在癌症细胞株和小鼠模型中报道的诸多耐药机制，其临床相关性尚不清楚，因为多数成熟的临床数据都来自PARP抑制剂二线治疗研究，许多患者的肿瘤亚克隆可能已对既往治疗（如紫杉类或含铂化疗）产生了某种形式的耐药，这些耐药可能导致对PARP抑制剂的交叉耐药。与二线治疗相比，一线PARP抑制剂治疗不仅能进一步延迟疾病进展，还能推迟耐药的发生，改变药物的潜在耐药机制，如逆转突变引起的PARP抑制剂耐药可能导致二线化疗的交叉耐药；而通过DNA末端保护缺失获得性耐药的BRCA1缺陷肿瘤仍可能对放疗或POLQ抑制剂有反应。因此，确定患者如何对PARP抑制剂耐药对于避免二线治疗的交叉耐药很重要。
奥拉帕利和niraparib均已获批一线维持治疗，更多患者在病程早期就能接受PARP抑制剂治疗，因此需要关注疾病进展后的治疗方法。肿瘤活检标本和/或细胞游离DNA的分子分析，可能对理解PARP抑制剂耐药的潜在机制以及PARP抑制剂与其他抗癌药物交叉耐药机制有很大帮助。另一个关键问题是，按计划停止治疗后疾病复发与维持治疗期间疾病复发，其驱动机制是否相同。未来研究还需要确定PARP抑制剂再引入对复发肿瘤是否有效。
临床研究正在尝试确定哪些患者最可能获益于PARP抑制剂治疗，并确定最佳治疗方案。PARP抑制剂耐药是HR缺陷肿瘤基因组不稳定的不可避免的结果，如上所述，克服PARP抑制剂耐药的靶向治疗方法很有限，因此系统地识别PARP抑制剂耐药肿瘤的易感性将是很重要的一步。体外和体内遗传学筛查数据将促进对耐药肿瘤的理解，药理学筛查有助于识别可靶向这些肿瘤的化合物。为了更好的研究与临床密切相关的PARP抑制剂的耐药性，通过基因工程产生PARP抑制剂耐药的小鼠肿瘤模型或是获得性耐药肿瘤衍生的PDX模型可能更有研究价值。PARP抑制剂疗效显著肿瘤的深入分析可能有助于确定对药物（超）敏感的分子标志。最后单细胞组学技术可能有助于更详细的研究患者的标本。
Dias MP, Moser SC, Ganesan S, Jonkers J. Understanding and overcoming resistance to PARP inhibitors in cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18(12): 773-791. doi:10.1038/s41571-021-00532-x
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