肺癌是我国发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤，而如何规范肺癌的诊断与治疗，造福于患者是临床医生必须面临的问题。本系列文章来源梳理于北京协和医院肿瘤内科王颖轶教授每周日晚直播的【肺癌规范化诊疗系列讲座】，方便各位医生老师随时温故知新。
北京协和医院 肿瘤内科 教授
副主任医师，硕士生导师
北京肿瘤病理精准诊断研究会，青年精准诊疗分会，副主任委员、秘书长
CSCO青年专家委员会，委员
北京癌症防治学会，免疫治疗不良事件管理专业委员会，副主任委员
北京癌症防治学会，肺癌免疫治疗专业委员会，常务委员
中国医药教育协会，肺部肿瘤专业委员会，委员
北京医学奖励基金会，肺癌青年委员会，常务委员
北京肿瘤防治研究会,肺癌分委会，委员
中国医师协会，结直肠肿瘤专业委员会青年委员会，委员
中国医疗促进会，神经内分泌肿瘤分会青委会委员
北京市肿瘤质控中心，化疗专业委员会，委员
北京肿瘤学会临床研究专委会，常务委员
在职期间以第一作者发表SCI收录及核心期刊文章近30篇
诊断并成功治疗了国内外首例伴副癌综合征的小细胞肺癌扁桃体转移
主持国家创新工程基金、中国医学科学院青年基金、CSCO专项基金及吴阶基金等多项基金数百万元
主攻肺癌，罕见病的发病机制和基因图谱建立，靶向免疫等精准医疗的探索
擅长肺癌/消化道肿瘤/乳腺癌的精准诊疗，包括靶向治疗、免疫治疗等领域，擅长移动医疗管理及患者随访
本期和大家分享驱动基因检测的方法和选择，主要介绍FISH、IHC和NGS检测的原理，以及基因重排、融合、扩增的区别。
根据NCCN指南对分子靶向治疗基因检测的推荐，对于ALK和ROS1主要的检测方法是FISH。
NGS、FISH、ICH的检测原理
二代测序（NGS）
NGS的全称为Next Generation Sequencing，也就是下代基因测序，简称为二代测序。二代测序包括全基因测序、全外显子测序和特定序列测序。
什么是全外显子测序呢？基因组中既包括外显子又包括内含子，外显子编码蛋白质，内含子不能，全外显子测序就是只检测全部的外显子。
什么是特定序列测序呢？比如，对于有EGFR突变的肺癌患者，耐药后需要检测是否有T90M突变，可以检测EGFR突变的 18、19、20、21号位点，甚至只检测20号T90M位点，这样逐渐缩小检测范围，即为特定序列测序。
NGS常用的测序方法有2类，即合成测序和连接测序。我们常见的454焦磷酸法和Solexa基因组分析均为合成测序，SOLiD高通量测序为连接测序。
454焦磷酸测序法的原理就是将DNA待测样品打碎成小的片段，然后和PCR扩增试剂双磷酸盐结合成油包水混合物，然后每个小片段都可进行独立测序，测序完成后将合成结果进行连续，通过荧光法进行测定。
Solexa基因组分析也是同样的道理，都是将荧光和待测基因进行结合。但是，由于加入的碱基具有封闭3’端的特性，所以每次只能延伸一个碱基。
SOLiD高通量测序这种连接法测序和454焦磷酸法、Solexa基因组分析原理不同。连接法测序不是将荧光部分直接和待测基因结合，而是将另外的碱基和待测碱基结合后荧光部分才挂上去。
荧光原位杂技技术（FISH）
荧光原位杂交技术（FISH）除了测序之外，可以检测基因重排、基因融合、基因和蛋白的扩增以及染色体关键区域的缺失。
FISH的范围主要取决于是否有相关的探针，即只能针对已知的探针，不能检测未知的东西。它的原理就是通过肿瘤原位和探针结合，探针带有荧光，会有各种颜色的信号，在荧光显微下进行显像。
免疫组化（IHC）
免疫组织化学染色（IHC）最大的特点就是快速、经济。
IHC主要检测表达的蛋白，比如PD-L1的检测、ALK、ROS1蛋白的表达等，也可以检测部分驱动基因改变的替代选择，如ALK和ROS1重排、MET扩增等。尤其在对于ALK的检测中，一般认为ALK蛋白的表达和FISH检测中基因的融合和重排是等同的。当然，也并不是所有的重排都可以和某种蛋白等同。
如图所示，A/C为ALK重排阳性的结果，可以看到在高倍显微镜下，ALK重排阳性的细胞内有深染的表达。B/D是ALK重排阴性的细胞，整体来说是局限性的表达，在高倍显微镜下染色程度较低。因此，ALK染色通常呈弥漫性阳性。
基因重排/融合
接下来介绍基因的重排和融合。基因重排就是DNA分子核酸序列的重新排列，可以调节基因的表达或形成新的基因。
有点类似我们常说的洗牌，比如原本离得比较远的两张牌，通过洗牌之后就离得比较近了。如图所示，染色体定向重排也可以把几个离得比较远的基因连在一起，组成一种新的组合。
在一个基因序列种，会有3’端和5’端，为了更形象理解，图中用红色标识表示3’端，绿色标识表示5’端，和后续要讲的FISH荧光信号一致。
如图所示，ALK和EML4原本是距离较远的基因，如果5’端和3’端发生颠倒，“头变成尾、尾变成头”，ALK和EML4就结合了，这就是EML4-ALK融合。EML4-ALK基因融合后，会导致原本正常的ALK信号不停启动，下游细胞不断进行纤细增殖，使转移抗凋亡的能力增加。
此外，基因缺失也会导致基因融合，比如果5’端和3’端中间的序列缺失后，ALK和EML4也会结合在一起，发生EML4-ALK融合。
总体来说，在非小细胞肺癌中，EML4-ALK融合的发生概率大约为3%~7%。
在FISH检测ALK重排的荧光信号中，正常情况下绿色和红色信号距离比较近，随着基因重排的发生，绿色和红色信号距离会相对较远，当两个信号的距离超过两个正常细胞核之间的距离时，就可以认为是异常。图中，左边为正常情况，右边为异常情况下的荧光信号。
那么，通过FISH检测基因重排时是否会有假阳性或者假阴性的情况呢？
如图所示，特殊情况的ALK重排是可能导致FISH假阴性的。尤其是像图中F所示，这种假阴性最具有迷惑性：即，5’端和3’端发生颠倒后，又发生了一个大片段的缺失，看似5’端和3’端的距离没变，是一个阴性的结果，但实际已经发生了2次改变，第一次是倒位，第二次是一个大片段的缺失。
IHC检测ALK重排的一项meta分析显示，IHC和FISH检测ALK重排的一致性高达95%，5% 的不一致主要是由假阴性的情况导致的。
研究表明，IHC对于1+、2+、3+蛋白表达亚组检测的敏感性和特异性都较高，基本都为98%~99%。
ALK基因融合的伴侣基因有很多种，除EML4外，还有很多non-EML4融合以及一些或长或短的变异体的发生，其中non-EML4融合约占1/4。NGS检测可以区分融合类型和non-EML4融合。
还有一种特殊形式，即双融合。如左下图所示，EML-4分为两半，ALK也分为两半，二者发生交叉异位，表现为EML4-ALK和ALK-基因X，从而出现双融合。如果染色体破碎过多，还可引起双融合或者多融合重排的发生。
并非所有的NGS敏感性都一样。由于融合通常发生在内含子上，因此对内含子检测的覆盖度是融合敏感性的首要关键因素。
全外显子组测序无法检测出基因融合，要进行全基因组测序。但因为全基因组测序太昂贵，实际临床中很少应用，一般只用于科研中。
因此，实际临床中检测基因融合常用免疫组化或者FISH来替代，比如ALK（内含子 18-19）、ROS1（内含子 31-35）、RET（内含子 7-11）、NTRK1（内含子 8-13）的检测。研究表明，检出敏感性与测序读长呈正相关。
对于EML4-ALK和非EML4之间的关系，多个研究表明ALK抑制剂治疗ALK融合罕见伴侣的疗效与EML4-ALK相当。
但是，对于EML4-ALK长变异体和短变异体的疗效不同。短的EML4-ALK通常预示着不良预后，可以简单理解为长变异体的生存期长，短变异体的生存短。
总体来说，二代测序和免疫组化的一致性为95%~99%，但也会存在不一致的情况。
比如，可能因为蛋白表达或者染色过程中出现问题，会出现免疫组化蛋白表达为阴性，但是二代测序为阳性的情况。另外一种情况是二代测序为阴性，免疫组化蛋白表达为阳性，这种情况通常很难判断哪个环节出了问题，也可能是二代测序没有检测到。
此外，因为免疫组化需要人工判读，极少出现假阳性的情况。
如图所示，为FISH、免疫组化和二代测序的一致性研究。
1）FISH和二代测序比较，可能会存在FISH阴性、二代测序阳性的情况，但是不会存在二代测序阴性、FISH阳性的情况。
2）二代测序和免疫组化的比较，互相都有一个是阳性而对方是阴性的情况。
3）FISH和免疫组化的比较，会存在免疫组化阳性而FISH阴性的情况，因为FISH更容易出现假阴性的情况。
所以，总体来说二代测序最准确，FISH是存在假阴性的，免疫组化因为需要人工判别较少出现假阳性。
三种检测方法与疗效的关系：因为二代测序准确率较高，ALK阳性患者接受克唑替尼治疗的中位无进展生存期（mPFS）最长，为11.1个月；免疫组化需要人工判别，出现假阳性的概率较低，mPFS居其次，为10.3个月；FISH检测组的mPFS最低，仅为8.8个月。
此外，克唑替尼对于FISH阳性、免疫组化或二代测序阴性的患者，也具有一定的疗效。尽管效果不佳，但也是一个不错的结果。
对于免疫组化阳性而FISH阴性的患者，PFS数据非常不错，PFS可以达到10~20个月甚至更高。
基因扩增
基因扩增包括拷贝数的增加，蛋白质的扩增，染色体的多倍体等情况。
如图所示，对于HER2扩增，可以看到在细胞膜表面，HER2会和多种二聚体结合，配体和受体结合后导致下游的信号级联放大，使得肿瘤生长、抑制凋亡、肿瘤细胞运动和转移的能力增强。
如此前介绍，可以通过FISH检测HER2基因扩增。如HER2/CEP17比值≥2.0，则认为是真正的扩增，如HER2/CEP17比值＜2.0，则很可能是多倍体。
在HER2的检测中，FISH主要是检测基因拷贝数，免疫组化主要是检测蛋白的表达。
在HER2检测中，蛋白的表达越高，免疫组化和FISH的一致性就越高。如果是IHC 3+，通常也可以认为FISH检测也是阳性，而对于IHC 2+和IHC 1+，则需要考虑进行FISH检测来帮助判断。此外，IHC 1+和FISH阴性的相关性也较高。
二代测序对不同区域的测序深度覆盖是不一样的。如图所示，二代测序对于关键区域的覆盖深度较深，对其他基本区域的覆盖深度较少。所谓覆盖深度即为测序的次数，主要是受肿瘤DNA占比、实验技术和分析性能的影响较大。
假如肿瘤细胞中ERBB2拷贝数分别为20/10/5三种情况。在10%肿瘤占比的情况下（ERBB2的拷贝数10%来自肿瘤细胞，剩下90%来自正常细胞），以肿瘤细胞ERBB2拷贝数20为例，计算公式为2*90%+20*10%=3.8，即两条正常染色体乘以90%，加上拷贝数20乘以10%的加权平均值，为3.8。如果拷贝数变成10，则加权平均值为2.8，拷贝数变成5，则加权平均值为2.3。
同样，如果肿瘤占比的比例不同，其ERBB2拷贝数均值也会发生变化。
所以，总体的拷贝数既要看肿瘤细胞中的拷贝数多少，也要看肿瘤细胞的占比，这种现象称为稀释现象。这种被正常DNA稀释的现象在ctDNA检测中更为常见。
正常细胞中，如果报告中显示CN=2.6时，实际上并不是“2.6倍扩增”，而是“1.3倍扩增”，相当于要除以2。
二代测序对于拷贝数变异检测（CNV）的检测下限较低，因此一个基因60%以上的bin在癌症样本中的覆盖深度显著高于基线水平。
二代测序检测CNV的测序深度会受样本质量的影响。比如，对于一些标本，如果时间过长，就会发生降解，因此背景就比较嘈杂，可能离中线值偏移就较小。此外，如果试剂盒有问题，也可能会出现假阳性。
总体来说，二代测序扩增检测的敏感性和准确性相关性的比例较高。
在MET扩增中，二代测序和FISH的检测的一致性较低。如图中所示，可以看出二代测序准确性较高，一般二代测序阳性的话，FISH检测基本都是阳性，但FISH阳性的话，二代测序不一定是阳性。此外，FISH和免疫组化之间也有交集。三者之间的一致性如图中左上方交集图所示。
如图所示，该病例中FISH检测为MET阳性，属于MET高水平扩增。研究显示，克唑替尼对于MET高水平扩增的非小细胞肺癌的治疗效果较好。
研究显示，二代测序对扩增水平高的患者获益更明显。
乳腺癌中染色体多倍体与HER2扩增的相关性约为30%。在图中可以看出，红色和蓝色着色点的比例并不都是大于2.0的情况，可能是在1.0~2.0之间，因此可能混杂了多倍体和真正的扩增。
如图所示，染色体多倍体与乳腺癌预后也具有一定的相关性。
总结
1）二代测序对大部分基因的检出率较高和准确性都较高，一般不会受到假阴性结果的影响。但实际检测中，可能会受样本质量、实验技术、测序深度等多种因素的影响。
2）二代测序、免疫组化和FISH多数时候一致性是不错的。
3）检测手段的选择应结合患者的经济状况、患者的病情、既往治疗、标本类型等多种因素综合判断。尤其对于初治患者，如果是阴性的结果，不要马上做判断，必要时可以完善多项检查，以免让患者错失最佳的治疗方案。
视频导引：
【轶说肺癌】王颖轶教授：FISH和IHC以及NGS不得不说的那些事儿（第十四讲）
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