尽管目前对肿瘤分子和遗传基础的研究已取得众多进展，转移仍然是肿瘤相关死亡的首要原因。对转移的起始和发展进行深入研究，对于发展治疗和预防转移性疾病的新策略是十分重要的。目前流行的理论假说为，转移是由少数有干细胞样功能的肿瘤细胞起始的。但是现在对人乳腺癌中转移起始细胞的鉴定仍然十分困难。
加州大学的研究人员首先采用微流控平台，在单细胞水平对乳腺癌转移过程中的多种基因表达进行测定，这些基因可以调控干性、多潜能性、上皮细胞间充质转化、乳腺谱系、休眠、细胞周期和增殖，共116种。研究首先对人正常乳腺上皮进行研究，发现其可分为两种谱系：包括干细胞在内的基底/肌上皮谱系和包括祖细胞及成熟细胞在内的管腔谱系。主成分分析和无监督层次聚类分析显示，在所分析的116种基因中，有49种基因在基底/干细胞和管腔细胞之间有表达差异，因而在后续实验中将这49种基因作为一个49-基因差异标签（图1）。
图1. 对正常人乳腺上皮细胞进行单细胞分析。a，FACS图显示一名代表性乳房成形术患者的基底/干细胞（Lin—CD49fhi EpCAMlo cKit—，蓝色）、管腔细胞（Lin—CD49flo EpCAMhi cKit—，黄色）和管腔祖细胞（Lin—CD49fmed EpCAMmed cKit+，红色），Lin = CD45/CD31。b，PCA图显示三个患者中鉴定的细胞群。c，细胞群之间有49个基因表达有显著差异。d，单个细胞和49-基因标签中每个基因的热图和聚类树状图。（Lawson DA, et al. Nature, 2015, 526: 131-135.）
然后，研究人员建立患者来源肿瘤的小鼠移植瘤模型（HCI-001、HCI-002和HCI-010），肿瘤细胞来自三种遗传背景，但均为ER— PR— HER2—。选择这一模型是因为这些患者来源的肿瘤侵袭转移性高，无靶向治疗手段，并且这一模型可保留初始患者肿瘤的包括转移趋向性在内的基本特性。为分离小鼠体内的转移癌细胞，研究人员采用了一种高度敏感和种属特异的FACS分析。研究发现，CD298在三种不同的人乳腺癌细胞中均有表达，但是在小鼠细胞中没有表达，因此可作为分离癌细胞的标志物。通过这一方法，研究人员对小鼠肺脏、淋巴结、骨髓、肝脏、大脑和外周血的转移细胞进行了分析，并把转移灶肿瘤分为两类：晚期转移灶（高负荷）和早期转移灶（低负荷）（图2）。
图2. 对移植瘤小鼠中人转移细胞的鉴定。a，FACS图显示代表组织中人hCD298+（红色）、小鼠mMHC I+（蓝色）和双阴性（黑色）细胞。b，FACS图显示低负荷和高负荷转移小鼠中hCD298+ mLin—（mTer119/mCD45/mCD31）细胞的百分比或数目。c，苏木素伊红染色显示低负荷和高负荷转移小鼠肺组织中的转移灶。d，直方图显示每个模型中转移负荷的分布。红箭头表示该动物用于单细胞分析。（Lawson DA, et al. Nature, 2015, 526: 131-135.）
研究人员对转移灶癌细胞进行主成分分析和无监督层次聚类分析发现，低负荷转移癌细胞与原发癌细胞的表型有很大不同，而高负荷转移癌细胞与原发癌细胞更为接近。对转移癌细胞的49-基因差异标签进行分析，发现低负荷转移细胞表达更高水平的基底/干细胞基因，而管腔基因的表达水平较低。大多数低负荷转移细胞为基底/干细胞样，而高负荷转移细胞为管腔样表型。除涉及干性的基因外，低负荷转移细胞还高表达多潜能性基因和EMT标志物基因（图3）。
图3. 早期转移细胞表现基底/干细胞特征。a，PCA图显示代表小鼠的转移和原发肿瘤细胞。b，柱状图显示49-基因标签中的基因以及多潜能性基因在低负荷和高负荷转移细胞中表达的差异。c，转移细胞和49-基因标签中每个基因的热图和聚类树状图。（Lawson DA, et al. Nature, 2015, 526: 131-135.）
研究人员随后通过几个实验证实了干细胞特性细胞在成瘤和转移过程中的重要作用。首先，在原发肿瘤体积较小时便将其切除，经过8周的转移过程，对肺脏转移细胞进行单细胞分析可见85.4%细胞为管腔样细胞。这说明，由原发肿瘤早期散播出去的早期转移细胞便可形成管腔样转移灶。在另一个实验中，研究人员将低负荷转移细胞接种至小鼠乳腺，在四个移植瘤中有两个成为大体积肿瘤；而对于原发肿瘤细胞，即使接种数目为上述低负荷转移细胞数目的100倍，也未能成瘤。因此，低负荷转移细胞有着较强的肿瘤起始能力。研究人员还发现，在原发肿瘤细胞中，大约有1.4%为基底/干细胞样表型，这部分细胞的比例决定了原发肿瘤转移的能力。
在细胞增殖能力方面，研究人员发现随着转移灶负荷的增大，细胞的增殖能力增强。低负荷转移细胞表达高水平的休眠相关基因，而高负荷转移细胞进入细胞周期，表达低水平的休眠基因和高水平的细胞周期促进基因，如MYC和CDK2。通过这一特点，研究人员尝试阻断转移细胞从休眠到进入细胞周期的过程来抑制转移进程。研究发现CDK抑制剂dinaciclib治疗荷瘤小鼠4周，24只动物中只有1只出现转移癌细胞，而溶剂对照组出现转移癌细胞的比例则高达44%（11/25）（图4）。因此，通过了解不同转移阶段的表型差异和基因表达。有助于寻找对抗转移更为有效的靶点和策略。
图4. 细胞周期抑制可阻断转移进程。a，细胞周期进程。b，休眠和细胞周期相关基因的表达。c，转移细胞和细胞周期相关基因的无监督聚类分析。d，转移灶MYC和磷酸化组蛋白H3的免疫荧光染色。e，Dinaciclib治疗疗程以及发生转移的动物百分比。（Lawson DA, et al. Nature, 2015, 526: 131-135.）
综上所述，加州大学的科学家们对人乳腺癌细胞转移起始和发展过程中的表型进行了分析，强调了干细胞表型对于转移过程的重要作用（图5），这一研究结果可指导发展新的策略来对抗转移这一肿瘤致死的险恶凶手。
图5. 转移过程中肿瘤细胞异质性模型。a，低转移负荷动物的转移细胞（蓝色）与高转移负荷动物的转移细胞（红色）有显著不同，前者干性、抗凋亡、EMT、休眠相关基因表达增加；后者更具异质性，大多数细胞增殖能力强。b，在原发肿瘤中约有1.4%的细胞为干细胞样表型，这些细胞具有高侵袭转移性，在外周血肿瘤细胞中占有16.7%，是转移性肿瘤的起源。（Lawson DA, et al. Nature, 2015, 526: 131-135.）
参考文献：
Lawson DA, Bhakta NR, et al. Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells. Nature, 2015, 526: 131-135.
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