分化型甲状腺癌（DTC）通常采用放射性碘（RAI）治疗，但RAI抵抗仍是一个重大的临床挑战。驱动去分化和RAI难治性的分子机制，特别是在BRAF V600E突变肿瘤中，尚未完全阐明。该研究对BRAF V600E突变DTC和RAIR-DTC组织样本进行RNA测序，以鉴定差异表达基因。结果发现Gadd45B在调节BRAF V600E突变甲状腺癌的分化状态和RAI敏感性中起关键作用。这些发现表明Gadd45B是恢复放射性碘难治性分化型甲状腺癌（RAIR-DTC）患者RAI反应性的有前景的治疗靶点。【肿瘤资讯】在此对研究进行整理，以期与读者分享甲状腺癌相关分子机制层面前沿进展。
研究背景
DTC占甲状腺恶性肿瘤的90%以上，全球发病率持续上升。RAI治疗是术后的标准辅助治疗。然而，转化为RAIR-DTC会降低疗效，是导致治疗失败和死亡的主要原因。RAIR-DTC约占所有DTC病例的10-15%，一旦发生远处转移，10年生存率低于10%。尽管目前的靶向治疗（如BRAF和MEK抑制剂）可部分增强RAI摄取，但仍需更大样本量的前瞻性研究的进一步探索。
Gadd45B作为一种应激反应基因，参与调节细胞周期、DNA修复和凋亡。既往研究表明其在乳腺癌、肺癌和结直肠癌中发挥抑癌作用，但在甲状腺癌生理学及RAIR-DTC中的作用知之甚少。本研究通过临床样本测序发现Gadd45B在RAIR-DTC中显著下调。机制研究显示，Gadd45B过表达可抑制MAPK通路，并通过促进MYCBP泛素化降解破坏c-Myc稳定性，进而影响TERT启动子活性，最终逆转去分化状态并恢复摄碘能力。
研究方法
本研究对BRAF V600E突变DTC和RAIR-DTC组织样本进行RNA测序，以鉴定差异表达基因。发现Gadd45B在RAIR-DTC中显著下调。在甲状腺癌细胞系和异种移植模型中进行了包括过表达和敲低实验在内的功能研究。通过免疫共沉淀、荧光素酶报告基因实验和Western blot评估了包括MAP3K4和MYCBP在内的下游靶点。在PDX模型中评估了重组Gadd45B蛋白联合BRAF与TERT抑制剂的疗效。
研究结果
Gadd45B是BRAF V600E突变甲状腺癌去分化的关键分子开关
基于TCGA数据库的大规模基因组学分析证实，BRAF V600E是甲状腺癌中发生频率最高的驱动基因突变。为了探究其在肿瘤去分化中的具体作用，我们对临床样本进行了全转录组测序（RNA-seq）。差异表达分析结果显示，与分化型甲状腺癌（DTC）组织相比，放射性碘难治性分化型甲状腺癌（RAIR-DTC）组织中Gadd45B的表达水平呈显著下调趋势。进一步的基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析提示，Gadd45B的低表达与MAPK信号通路的异常激活及富集密切相关。泛癌分析亦证实，Gadd45B在甲状腺癌中的表达普遍受到抑制。
在蛋白水平的验证中，免疫组化（IHC）染色结果表明，Gadd45B的表达强度与关键碘代谢基因（包括TSHR、Tg和TPO）的蛋白水平呈显著正相关。生存分析进一步揭示了其临床预后价值：Gadd45B低表达的患者，其无进展生存期（PFI）显著缩短。上述数据有力提示，Gadd45B不仅是预后不良的标志物，更是介导BRAF V600E突变肿瘤去分化的关键调节因子。
Gadd45B缺失削弱BRAF V600E突变甲状腺癌的摄碘能力并增强其恶性表型
体外细胞实验显示，在携带BRAF V600E突变的甲状腺癌细胞系（BCPAP和K1）中，Gadd45B的内源性蛋白水平显著低于BRAF野生型细胞系（TPC-1）。功能获得性与缺失性实验表明，Gadd45B在调控肿瘤生物学行为中起着至关重要的作用：过表达Gadd45B可显著抑制癌细胞的增殖与迁移能力，并诱导细胞凋亡；反之，敲低或敲除Gadd45B则促进了恶性表型。
尤为重要的是，Gadd45B过表达显著上调了钠/碘同向转运体（NIS）的蛋白表达水平，并大幅增加了BCPAP和K1细胞对放射性碘（RAI）的摄取量。利用高氯酸钠（NaClO4）进行的竞争性抑制实验证实，这种摄取增加是NIS依赖性的特异性过程。体内异种移植瘤模型进一步验证了体外发现：恢复Gadd45B表达不仅显著抑制了移植瘤的生长速度，还通过伽马计数证实了瘤内放射性碘积聚的显著增加。
Gadd45B通过负向调控MAPK通路逆转肿瘤去分化进程
机制研究发现，Gadd45B过表达能够负向调节MAPK通路关键激酶p-MEK和p-ERK的磷酸化水平。药物干预实验显示，使用BRAF特异性抑制剂PLX4720处理细胞后，Gadd45B的表达水平随之由抑制转为上调，这表明BRAF V600E是Gadd45B的上游负调控因子。
为了探索最佳治疗策略，我们将Gadd45B过表达与MAPK通路抑制剂（PLX4720或MEK抑制剂AZD6244）联合应用。结果显示，联合治疗产生了显著的协同效应，相比单药治疗，能更强效地抑制MAPK信号传导，并大幅上调分化标志物（NIS、Tg和TPO）的表达。在异种移植小鼠模型中，联合治疗策略在抑制肿瘤生长和增强RAI摄取方面均展现出了优越的体内疗效，成功实现了肿瘤的“再分化”。
MAP3K4与Gadd45B协同作用机制的阐明
为了寻找Gadd45B的下游互作蛋白，分子对接预测显示Gadd45B与MAP3K4之间存在强结合亲和力，免疫共沉淀（Co-IP）实验随后证实了两者在细胞内的直接相互作用。研究发现，Gadd45B过表达可上调MAP3K4的蛋白水平。
进一步的双重过表达实验（同时过表达Gadd45B和MAP3K4）显示，二者在抑制MAPK通路活性方面具有协同作用，并能大幅提升碘代谢相关基因及凋亡相关蛋白（Caspase-8、P38、P53）的表达水平。体内实验再次证实，这种双重过表达策略能显著缩小肿瘤体积并增强RAI的治疗敏感性，提示MAP3K4是Gadd45B发挥抑癌及促分化功能的重要下游效应因子。
Gadd45B缺失通过稳定MYCBP-c-MYC复合物激活TERT启动子驱动去分化
通过免疫沉淀-质谱联用技术（IP-MS），我们鉴定了MYC结合蛋白（MYCBP）是Gadd45B的另一个关键互作伙伴，且二者表达呈负相关。Co-IP证实了物理结合的存在。机制研究表明，Gadd45B通过促进MYCBP的泛素化-蛋白酶体途径介导其降解。
因此，当Gadd45B缺失时，MYCBP的降解受阻，导致其在细胞内积聚并稳定c-MYC蛋白。稳定的c-MYC进一步结合并激活TERT基因启动子，这一效应在携带C228T或C250T突变的启动子中尤为显著。反之，过表达Gadd45B或抑制MYCBP/c-MYC轴，可有效抑制TERT的异常表达并恢复碘代谢基因的转录，从而在表观遗传和转录水平上逆转去分化状态。
Gadd45B过表达联合MAP3K4及MYCBP抑制的体内协同疗效
在小鼠模型中，我们构建了多靶点干预方案。结果显示，Gadd45B/MAP3K4联合过表达并辅以MYCBP抑制的综合策略，能够最显著地抑制肿瘤增殖，延长荷瘤小鼠的生存期，并大幅提升肿瘤组织的RAI摄取率。免疫组化分析证实，联合治疗组肿瘤组织中NIS、Tg、TPO阳性细胞比例显著增加，而去分化驱动因子c-MYC阳性细胞显著减少。此外，将Gadd45B过表达与PLX4720及端粒酶抑制剂BIBR1532联合使用，也显示出了卓越的抑瘤效果和促摄碘能力，证实了多通路联合阻断的必要性。
重组Gadd45B蛋白联合靶向治疗在PDX模型中的转化医学价值
为了评估临床转化潜力，我们在RAIR-DTC患者来源的异种移植（PDX）模型中测试了重组Gadd45B蛋白的疗效。结果令人振奋：重组Gadd45B蛋白给药显著抑制了肿瘤生长并增强了RAI摄取。
更重要的是，该蛋白与PLX4720和BIBR1532联用表现出强大的协同效应，能够显著下调BRAF活性和TERT启动子活性，上调碘代谢关键蛋白，成功逆转了患者来源肿瘤的去分化表型。临床大队列分析进一步确立了Gadd45B的诊断价值：低Gadd45B表达是RAIR-DTC发生的独立预测因子（ROC曲线AUC=0.856），且与低MAP3K4、高MYCBP的分子特征高度相关。
研究小结与讨论
本研究系统揭示了Gadd45B在BRAF V600E突变甲状腺癌去分化过程中的核心调控机制。概括而言，BRAF V600E突变导致下游Gadd45B表达的显著下调，这一缺失引发了级联反应：一方面解除了对MAPK通路的负向抑制，导致通路持续激活；另一方面，通过阻碍MYCBP的泛素化降解，异常稳定了MYCBP-c-MYC复合物，进而激活TERT启动子。这两条路径最终共同导致碘代谢基因的表观遗传沉默和放射性碘抵抗的产生。
既往临床试验表明，单一使用MAPK通路抑制剂在恢复碘摄取方面疗效有限，且易产生耐药。本研究的创新点在于发现了Gadd45B作为一个多效性节点，其与MAP3K4的相互作用不仅能抑制MAPK通路，还能通过激活p38-p53轴促进碘代谢蛋白的表达。此外，阐明Gadd45B-MYCBP-c-MYC-TERT轴的调控机制，为理解RAIR-DTC的发生发展提供了全新的分子视角。
在转化医学层面，我们利用多种临床前模型（包括高保真的PDX模型）验证了恢复Gadd45B水平（无论是通过基因过表达还是直接给予重组蛋白）联合现有靶向药物的显著疗效。这表明Gadd45B不仅是预测RAI疗效的潜在生物标志物，更是极具开发价值的治疗靶点。虽然本研究尚未深入探讨Gadd45B在肿瘤免疫微环境中的作用，且重组蛋白进入细胞的具体机制仍需进一步解析，但现有数据已充分支持将MAP3K4–MYCBP–c-MYC轴及Gadd45B作为未来临床转化的重点方向。
综上所述，Gadd45B缺失是驱动BRAF V600E突变RAIR-DTC放射性碘抵抗的关键始动因素。通过恢复Gadd45B表达，能够从多维度阻断去分化信号，显著恢复耐药肿瘤对RAI的敏感性。本研究成果为RAIR-DTC的精准治疗提供了坚实的理论基础，并指出了极具前景的新型联合治疗策略。
Halim ÖZÇEVİK, et al. Genetic mutations and prognostic indicators in differentiated thyroid cancer: a molecular perspective. Turk J Med Sci. 2024 Dec 25;55(1):72–81.
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