肺癌精准治疗正面临一个关键挑战：现有基因变异数据主要基于欧美人群，而中国等非白人群体研究严重不足。近期发表于《International Journal of Molecular Sciences》的研究，首次系统揭示了拉丁美洲非小细胞肺癌患者中MET基因变异的分子特征与治疗敏感性。这项涉及智利、巴西、秘鲁三国1560例患者的研究，不仅发现了更高效的RNA检测方法，更鉴定出两个具有临床治疗价值的新型MET变异。这些发现对优化中国人群的基因检测策略、拓展靶向治疗适应症具有重要参考价值。
研究背景
非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例85%，其精准治疗高度依赖基因变异检测。MET基因作为重要治疗靶点，其14号外显子跳跃变异（METex14）发生率在欧美人群约2-3%，但其他人群数据匮乏。现有诊断主要基于DNA测序，但对剪切变异的检测灵敏度不足。拉丁美洲作为基因特征特殊的混合人群，其MET变异特征及治疗反应数据长期缺失。本研究通过52基因NGS检测，首次系统揭示了南美人群MET变异的分子特征，并创新性结合RNA测序提升METex14检出率。研究发现南美人群MET变异发生率（8%）显著高于欧美人群（4%），且存在大量意义未明变异（VUS），为拓展精准治疗提供了新方向。
研究方法
研究团队采用二代测序技术（Oncomine Focus Assay）分析1560例患者肿瘤样本的DNA/RNA变异。通过生物信息学工具（CADD、SIFT、PolyPhen-2）预测VUS的致病性，选择T992I和H1094Y两个高频变异进行功能验证。使用HEK293T、BEAS-2B和H1993细胞系，通过Western blot、增殖迁移实验评估变异对c-Met信号通路的激活效应。采用3D细胞球模型和分子对接模拟，测试克唑替尼、卡马替尼、赛沃替尼等MET抑制剂的敏感性。
结果
1、南美洲NSCLC患者METex14跳跃突变和VUS的发生率较高
在本研究纳入的南美洲队列中，1560例患者（NCT03220230）发现了NSCLC可操作基因中影响蛋白质的变异（单核苷酸变异、插入缺失和基因融合）。研究将这些患者的临床信息和变异的DNA流行率，与从GENIE数据库中选取的18857例非西班牙裔/非拉丁裔白人NSCLC患者的子集队列进行了比较（图1）。与南美洲队列相比，KRAS基因在白人中的突变率较高（37% 对 20%）。而在南美洲NSCLC队列中，ALK（9% 对 5%）、ERBB2（8% 对 4%）和 MET（8% 对 4%）基因的突变率则显著更高（图 1B）。
2、RNA 和DNA MET 测序分析显示，在诊断METex14跳跃突变方面存在差异
19 个 METex14 变异阳性的DNA样本在剪接供体（SD）位点区域存在单核苷酸变异（SNVs）和缺失。有趣的是，对这些肿瘤活检样本（TBx）的分析显示，在 MET 的剪接区域出现了两个单核苷酸变异（图2A，受影响的DNA区域用红色表示）。在 RNA 分析中，72例患者的外显子 13 和 15 融合的 RNA 读数在 20 到 67000 之间（图 2B）。然而，按照 Oncomine Focus Assay 用户指南的建议，48.6%（35/72）的患者经确认 METex14 呈阳性（RNA 读数阈值 > 120），这部分患者被称为高 RNA 读数亚组。RNA 读数少于 120 的 37例患者被归类为不确定（低 RNA 读数亚组），如图 2C 所示。
在 RNA 诊断为 METex14 的患者中，53.9% 的患者DNA检测 METex14 呈阴性（图 2D），即使在那些 RNA 读数为 3170 - 9487 和 12301 的患者中也是如此。此处，DNA 覆盖度与 RNA 读数之间的皮尔逊相关性为 R=0.45，P 值为 0.02，其中DNA读数为零意味着未检测到 METex14 变异。这种中等程度的相关性表明，在 45% 的病例中，RNA 读数的增加往往会使DNA读数增加相同的单位。
对于 RNA 读数少于 120 的 35例患者，20%（7例患者）的DNA显示存在变异，位于 14 号外显子 5' 端的 SD 区域（图 2A，最后 7 个DNA区域为红色，以及图 2D）。此处，低 RNA 读数亚组与其DNA覆盖度之间的皮尔逊相关性为 R=0.38，p 值 = 0.026（图 2E），这表明在 38% 的病例中存在中等程度的相关性，说明DNA和 RNA 对 METex14 的诊断存在中等程度的相关性，与 RNA 读数的大小无关。
然而，等位基因频率（AFs）与 RNA 读数的数量无关（图 2F）。一些等位基因频率可能表明存在种系变异（等位基因频率约为 0.5）；遗憾的是，这些患者的种系变异信息无法获取。值得注意的是，这些低 RNA 读数的患者中，57.14% 在其肿瘤谱中未报告任何其他针对实体瘤靶向治疗适应症的可操作变异。不过，如果考虑到 ESR1（2.86%）、ERBB4（2.86%）和 PIK3CA（8.57%）不是肺癌中的可操作基因，这一比例可能会增加到 71.43%（图 2G）。
3、MET T992I 和 H1094Y 是最常见的预测驱动变异，通过 AKT 信号通路在非肿瘤细胞和NSCLC细胞中表现出生物学特征
VUSs占所有 MET 变异的 53.7%（图 1C），因此需要寻找那些可能具有潜在可操作性的变异：考虑到 c-Met 的功能结构域，研究者选择了那些影响近膜结构域（JM）和酪氨酸激酶结构域（TK）的变异（图 3A）。为了收集更多关于这些VUSs驱动性的信息，使用了如 SIFT、MutationTaster 和 PolyPhen-2 等生物信息学算法，来预测这些变异对蛋白质功能的潜在影响。变异被分为可耐受（T）、中性（N）或有害（D）。此外，联合注释依赖损耗（CADD）评分为 0 到 40 分，其中致病性潜力高分超过 25 分。最后，癌症基因组解释器（CGI）预测这些 VUSs 是过客变异，还是已知或预测的可操作变异。有趣的是，如热图所示，这些结构域中的大多数变异被预测为潜在驱动变异（图 3B）。两个最常见的被预测为驱动变异的 VUSs 是影响 JM 结构域的 T992I（11例患者）和影响 TK 结构域的 H1094Y（6例患者）。此外，在 17例携带 T992I 和 H1094Y 变异的患者中，41.2% 的患者在其肿瘤突变谱中没有任何其他驱动或可操作变异。总体而言，这些患者中有 57.1% 没有治疗选择，因为 PIK3CA（14.3%）、IDH2（7.1%）和 MTOR（7.1%）不是肺癌的可操作基因。
预测为驱动变异的 VUSs 分别在NSCLC细胞和非肿瘤细胞中诱导了迁移表型和增殖细胞的存活：使用蛋白质免疫印迹法（Western blots）证实了 T992I、H1094Y 和 METex14 变异在非肿瘤 HEK293T 细胞、NSCLC H1993 细胞和 BEAS-2B 细胞中的表达（图 4A - D）。表达 METex14、T992I 和 H1094Y 的 HEK293T 细胞在 HGF 孵育 24 小时后存活率增加，与 METex14 和 H1094Y 变异相比，T992I 变异的细胞存活率显著更高。此外，在任何实验条件下，NSCLC H1993 细胞对 HGF 均无反应（图 4E）。然而，这些细胞在 HGF 刺激下，通过伤口愈合百分比评估，显示出较高的迁移率（图 4F，G）。
VUSs T992I 和 H1094Y 增加了 c-Met 的自磷酸化和下游 Akt 的激活：为了了解这些变异是否通过 c-Met 激活诱导迁移和存活，对表达 Metex14、T992I 和 H1094Y 的 Hek293T 细胞的蛋白质提取物进行蛋白质免疫印迹分析，结果显示 c-Met 激活磷酸化（Metp）和 Akt 激活磷酸化（Aktp）水平较高（图 5A - C）。然而，表达 METex14、T992I 和 H1094Y 的 H1993 细胞的 Metp 没有变化；尽管如此，在 METex14、T992I 和 H1094Y 条件下，Akt 的激活磷酸化水平显著更高（图 5D - F）。在所有实验条件下，Metp/β- 肌动蛋白的水平都很高（图 5G），这表明 Metp 与 Met 的总表达量成比例增加（图 5H）。此外，支气管肺泡细胞 BEAS-2B 在 METex14、T992I 和 H1094Y 条件下，与基础表达相比，Metp 和 Aktp 也有所增加。
4、预测为驱动变异的 VUSs 在非肿瘤细胞和肿瘤细胞的二维和三维培养中对 c-Met 抑制剂敏感
c-Met 抑制剂，如克唑替尼、卡马替尼和赛沃替尼，已基于包含携带 METex14 肿瘤患者的临床试验获批。因此，研究者检测了克唑替尼、卡马替尼和赛沃替尼在携带 METex14 的 HEK293T 细胞中的半数抑制浓度（IC50）。然后，评估细胞对靶向治疗的反应，发现与未处理或对照细胞相比，所有治疗均降低了表达 METex14、T992I 和 H1094Y 变异的细胞活力（图 6A）。此外，用克唑替尼、卡马替尼和赛沃替尼处理后，表达 METex14 和 T992I 变异的细胞相对于其基础状态，活力下降。另一方面，与克唑替尼和赛沃替尼治疗相比，表达 H1094Y 的细胞对卡马替尼的敏感性较低。
赛沃替尼对三维（3D）培养细胞（球体）的处理：如先前建议，让球体生长 120 小时，直径不超过 500 微米（图 6B）。接种 48 小时后，用赛沃替尼处理球体 24 小时。药物释放 48 小时后，与未处理条件相比，表达 METex14、T992I 和 H1094Y 变异的球体对赛沃替尼处理的反应是增殖细胞活力下降，相对于基础状态，这强烈表明 VUS T992I 和 H1094Y 是可操作变异（图 6C）。
结论
本研究首次系统描绘了南美人群MET变异的分子图谱，证实RNA检测在METex14诊断中的核心价值，并发现T992I/H1094Y两个新型治疗敏感变异。这些发现对优化中国人群基因检测策略、拓展靶向治疗适应症具有重要启示。值得注意的是，METex14的RNA检测阈值仍需临床验证，且本研究未进行长期疗效跟踪。未来需要开展多中心临床研究，验证这些实验室发现在真实世界中的治疗价值，特别是针对不同人种的药物敏感性差异。
参考文献
Rivas S, Sepúlveda RV, Tapia I, et al. MET Exon 14 Skipping and Novel Actionable Variants: Diagnostic and Therapeutic Implications in Latin American Non-Small-Cell Lung Cancer Patients. Int J Mol Sci. 2024;25(24):13715. Published 2024 Dec 22. doi:10.3390/ijms252413715。
审批编号：CN-159473 有效期至：2025-08-07
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