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循环肿瘤DNA的检测方法（下篇）

03月10日

来源：金氪投行之家

ctDNA仅占cfDNA的0.1%~5%，且不同癌种、不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中含量差异较大。因此，需要超敏感方法来检测ctDNA携带的特征信息（包括突变、重排、拷贝数异常、甲基化等）。本文将分上、中、下三篇详细介绍ctDNA的检测方法。下篇将比较各种下游分析技术的优缺点，绘制ctDNA公司的检测技术图谱并总结三种常见技术的质评结果。

6. 各种下游分析技术的比较

纵观目前ctDNA的多种检测方法，不难发现不同方法各有利弊。ARMS是目前我国法规明确批准的血检方法、临床应用中相对普及、在EGFR已知突变的检测上优势明显。但检测范围局限于已知突变，且敏感度仅为70％。NGS是目前最热门的基因检测技术，在多通道平行检测和发现未知突变上独具优势，但存在技术和成本的瓶颈，实验室水平差异较大，目前缺乏相关法规支持，距临床应用尚存距离。ddPCR、SuperARMS均是近年发展起来的高灵敏度新技术，适用于已知突变的检测。ddPCR可用于特定突变的绝对定量检测，具有极高的敏感性，是目前ctDNA检测最稳定的技术，但该方法一次仅能检测少数突变位点，且不能检测融合变异，目前应用此技术进行ctDNA检测的试剂盒尚待开发中。与NGS类似，核酸质谱也可采用少量的样本一次完成多基因的检测，且其价格较NGS便宜，不需要复杂的生物信息分析。但核酸质谱的通量较NGS小，且不能完成绝对定量。EFIRM的技术核心在于电场诱导，它的优势是检测时间短、操作便捷、成本低。但是该方法目前仅完成了EGFR基因突变的检测，需要增加分析突变的数量并进一步提高灵敏度以促进大规模筛查。

ctDNA下游分析技术的比较
资料来源：宽华投研团队整理

7.ctDNA公司的检测技术图谱

目前国内公司主要采用ARMS（qPCR）、数字PCR和NGS方法对ctDNA进行检测，其中NGS最炙手可热，被大多数公司使用。少数公司采用核酸质谱方法，仅有一家公司（易活生物）采用EFIRM方法。

ctDNA公司的检测技术图谱
资料来源：宽华投研团队整理

8.三种常见ctDNA分析技术的质评结果

2016年11月国家卫生计生委临床检验中心（以下简称“临检中心”）发布了2016年全国ctDNA基因突变检测室间质量评价调查活动结果报告。参加本次质评的74家实验室回报的方法学包括数字PCR、NGS与ARMS，临检中心针对发放的10个血浆游离DNA样本的回报结果进行评价。
8.1数字PCR
数字PCR是三类方法中最新的一种技术，本次质评仅有11家采用此方法，但合格率达到100%，没有一家实验室报出假阴性结果，只有3个样本报出假阳性结果。说明这种方法相对最稳定，而且易于掌握、准确度高，特别适合ctDNA检测及临床推广。
8.2ARMS
ARMS方法具有操作简单、成本低廉的优势，在病理组织分子检测中已被广泛应用，是目前三类方法中临床接受度最高的技术。本次质评共有14家实验室采用ARMS，其中10家获得满分，3家不及格。报出假阴性结果的样本有2个，其灵敏度不及数字PCR；报出假阳性结果的样本有7个，说明其稳定性也欠佳。因此在液体活检领域，数字PCR相比ARMS更具临床应用潜力。
8.3NGS
NGS能同时检测多个基因的多种不同变异形式，是目前国内最热门的基因检测技术，参加本次质评采用NGS方法的实验室最多，共有43家。虽然本次质评只对等位基因百分比高于0.5%的突变予以评价，并未将检测下限设定至许多公司宣传的0.1%甚至更低，但是合格的实验室只有34家，其中拿到满分的仅17家，另外还有9家不合格，甚至6家得了0分。从10个参评样本结果来看，每个样本都有部分实验室报出假阳性结果（100%），报出假阴性结果的样本有5个（50%）；另外各个实验室报告的突变等位基因百分比完全没有可比性，说明NGS方法是相对最难稳定与掌握的技术。

由于NGS整个实验流程相比ARMS与数字PCR更为复杂，因此对结果产生干扰的因素也会更多，导致各个实验室的回报结果差异最大，因此要普及NGS检测ctDNA技术需要对实验操作流程与数据处理以及标准化提出更高的要求。

三类常见ctDNA检测技术的总体质评结果及技术特点
资料来源：病理柳叶刀，宽华投研团队整理

小结
ARMS、数字PCR和NGS是目前ctDNA检测的主要方法，少数公司采用核酸质谱和EFIRM方法。数字PCR是目前最稳定的技术，当检测已知的少数变异时优势明显。NGS是目前最热门的检测技术，当平行检测多种基因和未知变异时优势明显。核酸质谱和EFIRM是最近几年应用于ctDNA检测的技术。当平行检测多种基因且考虑成本因素时，优选核酸质谱。当需要检测操作简单、检测速度快捷、检测成本低廉时，优选EFIRM。总之，各种检测方法各有利弊，检测ctDNA时需要根据临床应用的目的并结合各自的优缺点选择不同的技术。

责任编辑：Linda
排版编辑：Linda