液体活检是一种在体液中检测生物标志物的微创检测方法，在肿瘤领域正在获得越来越多的临床应用。循环肿瘤DNA（ctDNA）是包括非小细胞肺癌（NSCLC）在内的多种癌症的关键肿瘤衍生物，ctDNA在早期肺癌应用包括肺癌筛查、微小残留病变（MRD）的检测及在影像学进展前预测复发等。不久前，一篇发表于CANCER TREATMENT REVIEWS（IF=9.6）的综述全面介绍了ctDNA在早期肺癌中的应用现状以未来展望[1]。【肿瘤资讯】特邀解明然教授进行点评。
ctDNA的检测方法
目前可用的ctDNA检测和分析技术主要包括聚合酶链反应（PCR）和下一代测序（NGS）技术。其中，PCR技术历经多代发展，目前仍然面临多重检测能力较低的问题，只能同时分析有限数量的位点。NGS则通过在扩增步骤前添加独特的分子标识符或分子条形码实现了更高的灵敏度。目前，已经开发了多种技术利用分子条形码的力量，包括基于扩增子的技术如Safe-Sequencing System（Safe-SeqS）、Tagged-Amplicon深度测序（TAm-seq），以及基于捕获的技术如CAncer Personalized Profiling by deep sequencing（CAPP-seq）。有希望的ctDNA检测检测方法则包括甲基化、片段组学和拓扑分析。
ctDNA用于肺癌筛查
肺癌是全球导致癌症相关死亡的主要原因，全球每年约180万人因肺癌而死亡[2]。尽管近年来肺癌治疗取得了进展，但总体生存趋势仍然不尽人意。值得注意的是，仅有约三分之一的肺癌在局部或局限期阶段被诊断，通过筛查发现早期肺癌，有望提高肺癌的总体生存率。
传统的肺癌筛查技术是X光，直至20世纪90年代CT的应用逐渐增加[3]，并成为公认的肺癌早筛最有效的方法。一项系统评价和荟萃分析比较了9项随机临床试验，对比了CT肺部筛查与使用胸部X光片筛查在具有吸烟习惯的人群中的效果，结果显示CT筛查可显著降低肺癌相关死亡率（总体汇总风险比，RR 0.87，95% CI，0.78-0.98）[4]。然而，CT的使用也存在误诊、成本增加、辐射暴露等风险，这也导致了CT筛查更多的常规应用。
以尽量小的侵入性有效检测癌前病变，是肺癌早筛的关键。结合大数据技术，检测生物标志物或许是更好的方法。有效的肺癌筛查生物标志物可以提前预测癌症并降低筛查成本，同时不增加死亡率[5]。ctDNA便是有希望的生物标志物，首次大规模人群筛查研究在鼻咽癌患者中开展，基于EB病毒DNA进行检查，目前大多数基于ctDNA的肺癌筛查旨在提高CT的灵敏度和特异性[6]（NCT03774758、NCT04814407、NCT05432128等）。
尽管仍然存在一些因素阻碍ctDNA作为诊断工具的使用，例如甲基化，但仍然有多项研究正在评估将ctDNA作为肺癌筛查的效果。旧金山大学正在进行一项前瞻性观察性研究，研究对象是参加肺癌筛查计划的个体，旨在确定ctDNA检测在分层肺癌发生风险中的性能（NCT03774758）。中国的一项研究结合了低剂量CT扫描和ctDNA甲基化检测评估，目的是提高单一影像的诊断率，减少过度检查（NCT05432128）。肺癌突变联盟正在招募疑似早期肺癌患者，计划进行诊断活检；在不同时间点收集ctDNA，以将评估ctDNA与临床结果的相关性（NCT04712877）。此外，也有一些数字化平台正在开发协助检测和定量ctDNA水平的方法[7-9]。
总之，液体活检在肺癌筛查中的应用已经取得了显著进展，并具有巨大潜力，未来的重点在于优化检测性能，完善生物标志物的选择，并建立检测标准，并证明其对生存的积极影响。
ctDNA用于MRD检测
RECIST标准将完全缓解定义为所有病变（包括靶病灶和非靶病灶）在影像学检查中消失[10]。这可以通过系统治疗、放疗或手术实现。目前，CT是最常用的疗效评估技术，但其检测极限为2~3毫米，很可能无法检测到残留的微小病灶，因此需要更精细的检测手段。辅助治疗的制定基于对复发风险的评估，但目前仍然没有公认的最佳手段评估治疗后的复发风险，其他临床特征如淋巴结受累等也还需要进一步的验证。而ctDNA便是一种极有希望的生物标志物，可用于早期识别疾病复发、风险分层、预测复发和指导后续治疗。
可切除的早期和局部晚期NSCLC
前瞻性数据显示， MRD检测提示根治性治疗后肿瘤细胞仍然持续存在，这是一个重大突破，将助力制定辅助治疗方案[11]。近期一项纳入1251例接受根治性治疗肺癌患者的16项研究的荟萃分析显示，无论是治疗后不久还是在长期监测期间，ctDNA MRD预测疾病复发的特异性很高（AUC 0.86-0.95），但敏感性中等（0.41-0.76），这很可能是由于在各类肿瘤中，有一半疾病复发患者的MRD很低（<0.01%）。
另一项纳入了784例局晚期NSCLC患者的8项前瞻性研究和1项回顾性研究的荟萃分析发现，ctDNA对MRD检测的汇总敏感性和特异性分别为0.58和0.93[12]。治疗前后ctDNA阳性与更差的无复发生存期（RFS）（HR，3.82和8.32）和更差的整体生存（OS）（HR，3.82和4.73）相关。
在早期NSCLC围术期免疫治疗临床研究中，也使用了ctDNA检测。双盲、随机III期CheckMate-816研究中评估了纳武利尤单抗新辅助治疗联合铂类双药化疗的疗效。结果显示，接受新辅助免疫联合化疗的患者，MRD清除率更高，而且与病理完全缓解（pCR）率和无事件生存期（EFS）显著相关[13]。然而，尽管ctDNA可以被视为pCR的替代标志物，但只有一半的pCR患者实现了ctDNA清除。在IMpower010研究的探索性分析中，无论术后ctDNA状态如何，阿替利珠单抗的辅助免疫治疗在PD-L1 TPS≥1%患者中均改善了DFS和OS[14]，62%的ctDNA阳性患者在化疗后，免疫治疗之前实现了ctDNA清除，ctDNA的清除与DFS的改善相关，化疗后辅助免疫治疗的获益则在ctDNA阳性和ctDNA阴性队列中都得到体现。在ctDNA阴性患者队列中，免疫治疗与更长的转阳时间（HR 0.6）和DFS的改善（HR 0.70）相关。在39名ctDNA阳性患者的纵向评估中，接受免疫治疗的患者的ctDNA水平稳定，而在对照组中增加了10倍。
综上，在早期NSCLC中，ctDNA可以作为一种有用的非侵入性工具，用于评估NSCLC的分子特征。Guo等人[15]评估了41名NSCLC患者手术切除肿瘤前后ctDNA的变化，发现在包括EGFR、KRAS、TP53、BRAF、PIK3CA和ERBB2在内的几个基因中，组织和血浆样本之间的总体一致性为78.1%。这些数据证实了ctDNA评估在早期NSCLC患者中的预后、风险分层、早期识别复发和检测分子变化等方面的价值。然而该结果应用于临床实践之前还需要更多前瞻性研究的验证。
不可切除的局晚期NSCLC
不可切除局晚期NSCLC的标准治疗是同步放化疗后序贯免疫治疗的PACIFIC模式。关于ctDNA在PACIFIC模式中的应用目前没有最新数据，但既往研究表明，在同步放化疗后检测到ctDNA与预后较差相关，值得进一步研究[16]。Moding等人[17]对65名接受放化疗治疗后的局部晚期NSCLC患者（包括免疫维持治疗的28例患者）的218个样本进行了CAPP-Seq ctDNA检测。结果显示，放化疗后ctDNA阴性患者的预后更好，无论是否使用免疫维持治疗，而放化疗后MRD阳性患者的预后则通过免疫维持治疗得到了显著改善。
在一项前瞻性、观察性研究中，Yang等人[18]招募了59名患者，其中55名有可用的预处理血浆样本被纳入基线分析，47名接受了包括放化疗或放疗（CRT/RT）的标准治疗。在不同时间节点的ctDNA分析显示，1个月时ctDNA阴性患者的PFS和OS显著优于ctDNA阳性患者（分别为p < 0.0001和p = 0.0016），这提示这个时间点作为预测疾病复发的潜力。此外，所有血浆样本中ctDNA阴性患者以及ctDNA阳性但已清除的患者，与持续检测到ctDNA的患者相比，PFS和OS显著更长（p = 0.033）。
ctDNA还可用于风险分层。Pan等人[19]进行的一项前瞻性研究纳入共139名不可切除的局部晚期NSCLC患者，在根治性放疗期间，可检测到ctDNA的患者占90.1%，随着治疗的进行，观察到ctDNA的下降趋势（p < 0.001），在84.7%的患者中，MRD的检测先于影像学平均4.0个月观察到疾病进展，放疗后ctDNA阴性患者的PFS优于ctDNA阳性患者。此外，接受免疫维持治疗的ctDNA阳性患者中有40.6%的PFS优于未接受治疗的患者，而在ctDNA阴性组中PFS没有显著差异。早期未检测到ctDNA的患者比晚期清除的患者有更好的PFS（22.9个月vs. 10.3个月，HR = 0.29，95% CI：0.12–0.71，p < 0.001），但未观察到OS的显著差异（HR = 0.68，95% CI：0.23–2.03，p = 0.478）。有趣的是，早期未检测到ctDNA的患者似乎无法从免疫维持治疗中获益（20.3个月vs. 22.9个月，HR = 0.95，95% CI：0.38–2.38，p = 0.917）。
总之，在不可切除NSCLC中，ctDNA有潜力为患者进行分层，提示患者是否需要接受免疫维持治疗，也可以监测患者对根治性治疗的反应。然而该结果应用于临床实践之前同样需要更多数据的支持。
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