肺癌领域学术盛会世界肺癌大会（WCLC）即将于2023年9月9日~12日在新加坡召开，8月16日，WCLC官网公布了研究摘要。III期非小细胞肺癌（NSCLC）是一种高度异质性疾病，其中III期NSCLC是否具有手术切除的可能性一直都是复杂且有争议的。本期【肿瘤资讯】小编带您抢先一览WCLC口头报告专题“Novel Targets and Overcoming Drug Resistance”，关注该领域有哪些新的见解。
奥希替尼诱导的表观遗传和转录重编程驱动NSCLC的BRD4-POUF-PDGFRB-YAP-EMT轴耐药
讲者：哈佛大学医学院 A-V. Hartley教授
标题：Osimertinib-induced Epigenetic and Transcriptional Reprogramming Drives a BRD4-POUF-PDGFRB-YAP-EMT Axis of Resistance in NSCLC.
研究介绍
奥希替尼的获得性耐药性是 NSCLCs 获得持久治疗反应的主要限制因素。虽然已经确定了多个可操作的基因突变，但在>50％的耐药肿瘤中无法确定基因组机制，因此这些患者没有有效的二线靶向治疗选择。以前，我们发现YAP/TEAD和ERK1/2的重新激活是两个主要的非突变反调节途径，可削弱表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂介导的细胞凋亡，促进了耐药耐受性（DTP）和耐药状态的形成。众所周知，癌细胞通过治疗诱导的 "RTK开关"，对替代的非突变受体酪氨酸激酶（RTK）产生依赖，从而逃避酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗。然而，人们从未在奥希替尼耐药的背景下探讨过交替RTK信号传导与YAP/TEAD/ERK1/2之间的关联。
研究方法
为了确定哪些RTK主要参与了奥西美替尼诱导的“RTK切换”，我们采用RNAseq和Western印迹法，对使用药物或奥希替尼治疗24小时、72天或10天（DTP状态）的NSCLC细胞进行了RTK转录本和蛋白质表达分析。然后，我们选择了差异表达最大的RTK，分别通过pERK1/2酶联免疫吸附试验和YAP报告基因活细胞监测，测试了它们在与EGFR共同抑制时同时抑制 pERK1/2 和 YAP/TEAD 的能力。血小板源性生长因子受体β（PDGFRβ）成为这些通路的主要新型共调控因子，随后，研究人员使用功能缺失 RNAi 或药理抑制方法研究了它在奥希替尼介导的细胞凋亡中的作用。通过细胞滴定管（CTG）和caspase 3/7 incucyte活细胞成像技术分别评估了细胞活力和凋亡。通过对YAP亚细胞定位和pS127状态的免疫荧光成像评估了PDGFRβ介导的YAP调节机制。最后，我们通过整合转录因子-调控因子相互作用组阵列、ChIP-seq、cut & run和ATAC-seq分析获得的数据，确定了奥希替尼诱导的PDGFRβ和其他RTKs去抑制的表观遗传学/转录基础。
研究结果
我们发现EGFR突变的 NSCLC 通过转录抑制 RTKs 来逃避奥希替尼诱导的死亡，RTKs 主要依赖于表皮生长因子受体β。机理研究显示，奥希替尼诱导BRD4和多能POU域转录因子Oct4、Pit-1和Brn-3动态地共同招募到长程超级增强子（SE），从而促进了PDGFRβ的上调。重要的是，通过抑制ERK1/2再激活、YAP活性/核转位和YAP介导的EMT因子诱导，遗传或药物联合抑制PDGFRβ可使NSCLC细胞在药物幼稚期、耐药期和耐药期对奥希替尼更敏感。
研究结论
我们从机制上证明了一种新型治疗诱导的 BRD4/POUF 表观遗传/转录介导的 "RTK 开关 "机制，该机制可激活 YAP/TEAD 和 pERK，从而驱动对奥希替尼的适应性耐药。重要的是，联合靶向表皮生长因子受体和表皮生长因子受体β可通过抑制ERK1/2反弹和破坏表皮生长因子受体β-YAP-EMT轴增强奥希替尼的凋亡效应。总之，这些数据为在 NSCLCs 中进行抗EGFR 和 PDGFRβ 靶向联合治疗提供了令人信服的理由。
一种新型抗EGFR/CD3双特异性抗体对奥希替尼耐药的NSCLC显示出强效疗效
讲者：上海市肺科医院 郭浩越教授
标题：A Novel Anti-EGFR/CD3 Bispecific Antibody Exhibits Potent Efficacy for Osimertinib-resistant NSCLC.
研究介绍
约50%的病例对奥希替尼产生耐药的机制仍不清楚，开发新的治疗方法迫在眉睫。在此，我们探讨了BC3448（CD3×EGFR）在奥希替尼耐药的NSCLC细胞系和异种移植瘤中的抗肿瘤效果，BC3448是一种可激活T细胞并抑制表皮生长因子受体（EGFR）通路的BiTE。
研究方法
通过逐步递增H1975和HCC827细胞的奥希替尼暴露量，并将其维持在1µM奥希替尼浓度下，建立奥希替尼耐药细胞系（H1975-OR和HCC827-OR）。体外细胞毒性试验是将 PBMC 与 A549、PC9、H1975、HCC827-OR 和 H1975-OR 在梯度浓度下共培养 3 天，然后用 CCK8 测定裂解率。在梯度浓度下，将 3 名健康供体的 PBMC 与 H1975 以 10:1 的比例培养 2 天，然后进行流式细胞术测定。此外，用 BC3448 或 Panitumumab 处理 H1975-OR 2 天后，对其总蛋白进行 Sally Sue Simple Western 分析。HuHSC-NOG-EXL小鼠购自查尔斯河实验室。将 2.0×106 A549 细胞皮下注射到小鼠右侧腹部。实验小鼠分为四组，分别通过腹腔注射BC3448（0.3 mg/kg，biw）、抗PD-1（10mg/kg，biw）、抗CD3（0.3 mg/kg，biw）和帕尼单抗（0.3 mg/kg，biw）进行给药。
研究结果
BC3448 能明显促进 PBMC 介导的对所有 5 种细胞系的细胞杀伤作用（图 1A）。BC3448 对奥希替尼耐药的 HCC827-OR （1.854 pM）和 H1975-OR （1.291 pM）的 IC50 低于 A549（5.979 pM）、PC9（1.952 pM）和 H1975（1.684 pM）。与对照组相比，用 BC3448 培养 2 天后，CD69+ 早期、CD25+ 中期、HLR-DR+ 晚期活化的效应 T 细胞（CD62L- CD45RA+ ）和 CD8+ 幼稚 T 细胞（CD62L+ CD45RA+ ）的比例显著增加（均 P<0.05，图 1B）。在高浓度（10μM）下，BC3448 对表皮生长因子受体（EGFR）、pEGFR、JAK2 和 AKT 也有明显的阻断作用（图 1C）。在体内，BC3448 显著抑制了 A549 肿瘤的生长，而加入 PD-1 并未提高疗效（P<0.05，图 1D）。此外，BC3448将CD4+和CD8+ T细胞引导到肿瘤中，并刺激 CD4+ T 细胞上 CD69 和 Granzyme B 的表达以及 CD4+ T 细胞上 4-1BB 的表达（图 1E）。BC3448 在 H1975-OR 和 H1975 中的进一步体内实验正在进行中。
图1
研究结论
BC3448在体外和体内均表现出强效的抗肿瘤作用，可能是一种有前景的奥西美替尼耐药性非小细胞肺癌的治疗药物。
转录组学特征是TKI治疗后神经内分泌转化表型腺癌的治疗疗效的决定因素
讲者：多伦多大学 M.S. Tsao教授
标题：Transcriptomic Features as Determinant of Therapy Response in Neuroendocrine-Transformed Adenocarcinomas Following TKI.
研究介绍
大约10%的EGFR或ALK驱动的肺腺癌在接受酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗后会转化为神经内分泌癌。这些转化的肿瘤保留了腺癌的原始驱动突变，与表型转化而非新的原发性肿瘤发展一致。TKI诱导神经内分泌转化的潜在机制以及转录组学和免疫组化表型对疗效的影响仍有待进一步研究。
研究方法
我们从7名患者（6例EGFR和1例ALK）的活检标本中建立了8个患者来源的异种移植模型（PDX），这些患者在TKI治疗期间发展为神经内分泌癌。患者的肿瘤诊断包括小细胞癌（5 例）、大细胞神经内分泌癌（2 例）以及腺癌和神经内分泌癌混合瘤（1 例）。移植率为 100%。所有模型均进行了免疫组化、全外显子组和 RNA 分析。
研究结果
所有 PDX 模型都保留了神经内分泌癌的组织病理学特征，尽管有些模型显示出斑块状的腺癌形态，表明其具有一定程度的表型可塑性（表 1）。免疫组化和 RNA 测序分析显示，即使在纯神经内分泌形态的肿瘤中，神经内分泌标志物的表达也存在高度异质性。通过免疫组织化学检测，所有肿瘤的免疫组化都显示 RB1 表达缺失，TP53 和 NOTCH 体细胞事件的发生率很高，证实了这些基因在转化中的作用。然而，与NOTCH信号通路相关的基因在不同模型中的表达差异很大，而且与神经内分泌标志物的表达呈负相关。其中对五个模型进行了药物研究。其中两个模型的NOTCH相关基因表达较高，仍保留对TKI的响应。在神经内分泌转化的 ALK 驱动模型中检测到 ALK-G12R 突变，这可能是患者临床耐药的机制。相反，NOTCH相关基因低表达（神经内分泌标志物高表达）的两个模型对TKI没有反应。一个具有双型腺癌和神经内分泌癌的 PDX 模型显示，接受 TKI 治疗的小鼠中腺癌成分被根除，但对神经内分泌成分没有总体影响。
研究结论
我们的研究强调了TKI治疗后腺癌神经内分泌转化的复杂性。虽然这些转化的肿瘤在组织学上与神经内分泌癌一致，但神经内分泌标志物的表达存在显著的异质性，这可能会影响后续的治疗反应。我们的研究结果表明，NOTCH 信号通路在转化过程中起着关键作用，其激活/失活可能会影响对 TKI 的反应。这些发现提供的见解可能对针对 EGFR/ALK 驱动且进展为神经内分泌癌转化的患者制定治疗策略具有重要意义。
表1 患者活检样本和 PDX 样本的形态学发现
在肺癌患者来源的异种移植模型中，表观基因组药物效应对奥希替尼诱导的药物耐受持久性的影响
讲者：埼玉医科大学 Y. Inoue教授
标题：Epigenomic Drug Effect on Osimertinib-Induced Drug Tolerant Persister in a Lung Cancer Patient-Derived Xenograft Model.
研究介绍
了解表皮生长因子受体（EGFR）突变的肺癌对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）产生耐药性的机制对于提高TKI治疗的有效性至关重要。耐药持久型（DTP）肿瘤细胞可通过多种方式进入可逆的缓慢增殖状态，从而在TKI治疗中存活下来；表观遗传修饰是其中一种可能机制。他泽司他（Tazemetostat，Taz）是一种强效、选择性的 S-腺苷蛋氨酸竞争性小分子泽斯特同源酶 2（EZH2）抑制剂。EZH2可以通过组蛋白3（H3K27me3）中的Lys-27修饰改变下游靶基因的表达，从而影响细胞增殖、凋亡和衰老。我们在接受奥希替尼 (Osi) 治疗的 EGFR 突变肺腺癌患者来源的异种移植 (PDX) 模型中研究了 Taz 对 DTP 肿瘤再生动力学的影响。
研究方法
我们使用具有EGFR 第 19 外显子 delE746_A750 突变的 PHLC137 PDX 模型来生成体内 DTP 模型。小鼠被分为四组：药物组、Osi组（每天25mg/kg）、Taz组（500mg/kg，每周3天，包括1周的负荷期）以及Osi和Taz联合治疗组。我们分 3 个实验进行研究： (1）载体和Osi治疗；（2）载体和Osi+Taz联合治疗；（3）载体、Osi和Osi+Taz联合治疗。治疗平均需要持续 4 周才能产生稳定的 DTP 状态。对载体、Taz治疗、DTP和停药后重新生长的肿瘤进行组织学、转录组和染色质可及性与单细胞多组分析。
研究结果
Osi 和 Osi+Taz 联合疗法以相似的速度缩小了肿瘤，并在治疗开始后的 2-3 周内产生了 DTPs，而 Taz 单药疗法未诱导肿瘤缩小。停药后，所有Osi和Osi+Taz产生的DTP肿瘤都会重新生长。我们使用所有 3 项实验的汇总数据，比较了停药后肿瘤再生时间。停药后，Osi+Taz诱导的DTP肿瘤中位再生长时间为118天（95% CI 87-未达标），而Osi诱导的DTP肿瘤生长的中位再生长时间为44.5天（95% CI 34-未达标；P<0.001）。联合治疗的 DTP 肿瘤的组织学特征显示，相较于Osi治疗的DTP肿瘤，顽固细胞大幅减少，基质纤维化增加。此外，还将介绍有关 DTPs 和再生肿瘤细胞中发生的转录组和表观遗传学变化的 scMultiome 数据结果。
研究结论
我们使用 PDX 模型进行的研究表明，表观遗传学抑制剂 Tazemetostat 可增强奥希替尼的疗效，从而使停药后 DTP 肿瘤明显缩小并延迟再生。然而，持久性肿瘤并没有完全消失，这表明多种机制可能共同维持了DTP肿瘤细胞的存活。PDX可作为体内研究的模型，用于控制DTP肿瘤细胞的药物组合。
在单细胞水平识别肺癌神经内分泌表型转化的可塑性的早期和晚期标志
讲者：纪念斯隆·凯特琳癌症中心 J.M. Chan教授
标题：Identifying Early and Late Hallmarks of Plasticity in Neuroendocrine Transformation of Lung Cancer at Single-Cell Level.
研究介绍
细胞系可塑性是指细胞在进化压力下改变其表型状态的能力。这一过程介导了肺腺癌（LUAD）对分子靶向治疗的获得性耐药性，肺腺癌通过转化为小细胞肺癌（SCLC），这是一种典型表现为神经内分泌（NE）组织学特征的侵袭性癌症类型。这种转化后的 SCLC 比 LUAD 或新生 SCLC 的临床预后更差，转化后的总生存期不到一年。典型SCLC 本身可以通过典型、变异和非 NE 转录亚型之间的相互转化而表现出可塑性，非典型亚型显示出更强的转移性和耐药性增加，具有不同的治疗易感性。目前还不太清楚是什么因素驱动了SCLC转化或SCLC亚型转换。之前的研究未能很好地模拟肿瘤内部的异质性，因为这些研究对肿瘤进行了批量分析，只能估计平均表型。然而，SCLC转化往往会导致LUAD/SCLC肿瘤混合。
研究方法
我们试图捕捉SCLC转化过程中的全部转录异质性，并确定可塑性的分子决定因素，方法是对来自24名转化或合并NE组织学的患者的47个肿瘤和患者衍生异种移植物进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），并对17个新生SCLC肿瘤、10个同时发生EGFR/RB1/TP53突变的NSCLC肿瘤和4个肿瘤邻近的正常肺进行匹配的靶向DNA测序和对照参考进行比较。
研究结果
在评估的 305410 个单转录组中，我们发现了 132362 个 SCLC 癌细胞和 21760 个 NSCLC 癌细胞。我们试图比较转化前与从未转化的 NSCLC，以及转化后与原发性SCLC，以分别识别早期和晚期的可塑性特征。我们发现，在所有患者中，转化前 NSCLC 成分明显富含鳞状特征。与原发肿瘤相比，转化后的SCLC在不同患者中具有更大的表型多样性，这主要是由于变异型和非NE SCLC亚型的富集驱动，尤其是NEUROD1和YAP1-高亚型，后者在原发性肿瘤中完全不存在。在每个肿瘤内部，转化后的SCLC的瘤内亚型多样性明显高于原发性SCLC。同一患者的多个纵向时间点的肿瘤在后线治疗的压力下显示出亚型丰度的变化。在对SCLC亚型进行调整后，差异表达和通路分析表明，转化后的SCLC是一种不同于原发性SCLC的表型，它与残留的EGFR和NSCLC基因特征，以及神经干细胞、上皮-间质转化、MYC靶基因、AKT/MTOR信号、JAK/STAT炎症和染色质重塑等途径的特点共享。
研究结论
总之，我们发现了肺癌神经内分泌转化前后可塑性的早期和晚期变化。我们发现鳞状特征的出现可能是SCLC完全转化的前兆步骤，可作为可塑性进一步发展之前早期拦截的生物标志物。我们还发现，在转化后的 SCLC 组分内部，瘤内表型多样性随之增加，包括变异型和非NE 亚型，这可能是临床预后较差的原因。我们的研究表明，转化后的SCLC是一种不同于原发性SCLC的表型，其通路可能为抑制可塑性提供了新的潜在药物靶点，目的是恢复患者对靶向疗法的原始敏感性。
MET抑制剂特泊替尼可能抑制KRAS G12C非小细胞肺癌中的KRAS G12C和SHOC2
讲者：德国Trias i Pujol研究所 R. Rosell教授
标题：The MET Inhibitor Tepotinib Potentially Inhibits KRAS G12C and SHOC2 in KRAS G12C Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC).
研究介绍
在MET抑制剂耐药的外显子14突变NSCLC中观察到KRAS扩增，在索托拉西布（sotorasib）耐药的KRAS G12C NSCLC中观察到MET扩增。在 KRAS 突变的 NSCLC 细胞系中，MET和SHOC2对于类球体生长是必需的。SHOC2:MRAS:PP1C（SHOC2磷酸酶）复合物增加了KRAS突变NSCLC细胞中的RAS GTP负载和MAPK通路在最初的MEK抑制后重新激活。通过基于结构的药物设计（SBDD），我们研究了： 1）特泊替尼（Tepotinib）是否能像sotorasib（KRAS G12C 抑制剂）一样对接至KRAS G12C 95His 凹槽中；2）SHOC2磷酸酶复合物内配体（sotorasib和tepotinib）的构象和结合，以研究配体结合位姿和分子间相互作用以确保复合物的稳定性。
研究方法
我们用 KRAS G12C 和 SHOC2:MRAS:PP1C 复合物分别与 KRAS G12C 和 SHOC2 抑制剂 tepotinib、sotorasib 和 celastrol 进行了分子对接，以确定其结合亲和力、分子间相互作用以及配体结构与结合位点的互补性。体外生长抑制实验确定了经过3天处理后的细胞存活率。对sotorasib耐药的H358和H23 KRAS G12C NSCLC细胞进行了检查。并在雌性 BALB/c 裸小鼠体内进行了Western 印迹分析及H358 体内肿瘤生长抑制实验。
研究结果
根据SHOC2:MRAS:PPIC复合物的分子对接结果，Tepotinib的结合亲和力为-10.2 kcal/mol，而雷公藤红素（celastrol）的结合亲和力为-8.2 Kcal/mol。在定义的结合袋内，tepotinib与复合物的三个蛋白质都有相互作用（图2），这与celastrol不同，celastrol只与 SHOC2 和 MRAS 有相互作用。出乎意料的是，与sotorasib相比，tepotinib在靶向KRAS G12C时显示出更好的结合亲和力（-9.1 kcal/mol与-8.2 kcal/mol）。值得注意的是，tepotinib通过氢键、碳-氢键和π-硫键与突变蛋白质半胱氨酸12相互作用，与sotorasib的结合袋相同（图2）。在对 KRAS G12C sotorasib 敏感和耐药的 H358 和 H23 细胞中，tepotinib与 v-ATPase 抑制剂联用可产生肿瘤抑制作用。信号分析表明，tepotinib治疗抑制了 MET，恢复了 RGS3（与突变 KRAS G12C 产出较低有关）。在 H358 异种移植小鼠模型中，使用tepotinib和 v-ATPase 抑制剂可抑制肿瘤。
研究结论
通过硅学建模预测，tepotinib与 SHOC2:MRAS:PP1C 复合物和 KRAS G12C 有更多的相互作用和更好的结合亲和力（图2）。体内外数据表明，tepotinib的活性为在KRAS G12C中重新定位提供了机会。
图2
MET融合阳性非小细胞肺癌的分子特征
讲者：乔治敦大学隆巴迪综合癌症中心 C. Kim教授
标题：Molecular Characteristics of Non-Small Cell Lung Cancer with MET Fusions.
研究介绍
在非小细胞肺癌（NSCLC）中，MET通路可通过各种机制失调。MET第14外显子跳越突变和MET基因扩增都是MET激酶抑制剂的有效靶点。也有报道称，携带MET融合的NSCLC对MET抑制剂有反应。在此，我们对NSCLC中的MET融合进行了全面描述。
研究方法
在 Caris Life Sciences（亚利桑那州凤凰城）对 NSCLC 样本（n=29460）进行分子图谱分析。对所有样本进行了DNA下一代测序（592个基因面板或全外显子测序），并通过全转录组测序（n=21603）和ArcherDx FusionPlex检测（n=7858）检测融合。使用免疫组织化学（22c3 pharmDx; 阳性(+): ≥ 1%）评估PD-L1表达。肿瘤突变负荷（TMB）高定义为≥10个突变/Mb。从保险索赔数据中获取了真实世界的总生存（OS）信息，根据从取样开始到最后联系日期的时间计算Kaplan-Meier估计值。采用 Mann-Whitney U、chi-square 和 Fisher exact 检验，以 p<0.05 定义统计显著性，并对 p 值进行多重比较调整。
研究结果
在NSCLC患者中发现MET融合占0.10%（n=30）。最常见的MET融合伙伴是CAPZA2（36.7%，n=11）、CD47（26.7%，n=8）、ST7（10%，n=3）和GPRC5C（6.7%，n=2）。在MET融合阳性病例中，同时观察到MET扩增（16.7%，n=5）或MET 14外显子跳越（3.3%，n=1）。其他并发改变包括表皮生长因子受体（EGFR）突变（L858R，n=2；E746_A750del，n=1）、BRAF（V600E、L597Q，各n=1）、KRAS（Q61L，n=1）和RET-KIF5B融合（n=1）。EGFR和KRAS突变仅在CAPZA2-MET融合中发现，分别发生在3例（27.3%）和1例（10.0%）中。与无MET改变的患者相比，MET融合患者的中位cMET表达水平更高（115.6 vs 62，P=0.0019，q=0.08）。在有PD-L1表达数据的29个肿瘤中，22例（75.9%）PD-L1阳性，其中8例PD-L1低表达（1-49%），14例显示PD-L1高表达（≥50%）。25%的样本发现有高TMB。与未携带MET融合的NSCLC患者（n=16986）相比，携带MET融合的NSCLC患者（n=19）的中位总生存期（mOS）较低：mOS为7.8个月[95%CI：3.4-10.8] vs. 16.5个月[95%CI：16.0-17.1]，风险比为2.4[95%CI：1.5-3.8]，P<0.001）。
研究结论
MET融合是一种罕见的基因组改变，但具有潜在的可操作性。我们的研究全面描述了 NSCLC 中 MET 融合的特征，揭示了其不同的融合伙伴和共存的基因组改变。我们有必要开展进一步研究，以阐明MET融合对包括肺癌在内的各类癌症治疗的临床意义。
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