说起靶向治疗，肺癌绝对算得上应用得最为广泛与成功的领域之一，表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的治疗效果有目共睹[1]。
从理论上来说，EGFR-TKI的治疗效果与EGFR激活突变息息相关[2]，目前临床中检测EGFR突变的标准手段是二代测序[3]。然而，临床中发现EGFR-TKI治疗对20%-30%通过标准方法检测出EGFR突变阳性的患者无效[4]。因此，开发能够更准确地预测EGFR-TKI疗效的方法对于NSCLC患者的治疗具有重要的指导意义。
近日，四川大学华西医院的李为民教授、田攀文教授团队开发了可与EGFR结合的荧光探针（HX103），通过基于荧光探针的多色荧光激活细胞分选方法，量化NSCLC患者肿瘤中EGFR的活性水平，可作为预测NSCLC患者对EGFR-TKI治疗敏感性的有效方法，相关研究发表于《自然·通讯》杂志[5]。
在该研究中，HX103标记在NSCLC患者手术标本中区分野生型EGFR与EGFR激活突变时，总体一致性为82.6%，敏感性为81.8%，特异性为83.3%，而用于预测EGFR突变患者EGFR-TKI治疗效果的敏感性和特异性均达到了100%。虽然样本量较小，相关预测效果有待进一步研究，但毫无疑问该方法在预测EGFR-TKI治疗效果方面效果优异，具有很大的临床应用价值。
为了更好地预测EGFR-TKI对患者的治疗效果，研究人员跳出了检测EGFR突变的常规思路，而是通过更直接的基于结构的思路[6]，简单的来说，就是直接看EGFR-TKI能不能结合到异常激活的EGFR上。
基于此思路，研究人员首先拿第一代EGFR-TKI吉非替尼做尝试，将其连接到环境敏感的荧光基团上，设计了荧光探针HX103（在340和440纳米处呈现最大紫外线吸收，荧光激发波长440纳米，荧光发射波长为570纳米）。这种荧光基团在疏水环境中才会发出强烈荧光（蛋白的结合位点大多都是疏水性的），而在其余时候仅有微弱荧光，即只有连接了荧光基团的吉非替尼与EGFR结合后才会发出强烈荧光，这使得其具有很高的信噪比。
荧光探针HX103设计思路
紧接着，研究人员研究了HX103与野生型EGFR、L858R突变型EGFR和L858R/ T790M双突变型EGFR的结合模式，并证实了HX103与EGFR结合的模式与吉非替尼相似。
HX103与野生型EGFR、L858R突变型EGFR和L858R/ T790M 双突变型EGFR的结合模式
同时，研究人员还在体外验证了HX103荧光是否具有环境敏感性，结果显示，HX103在PBS缓冲液中无荧光，但在其中添加野生型或突变型（L858R和19del）EGFR后出现强烈荧光，但对T790M突变型EGFR结合时荧光较弱。这些结果表明了HX103荧光具有环境敏感性，且对野生型、L858R突变型和19del突变型EGFR亲和力较高，对T790M突变型EGFR亲和力较低。
HX103荧光具有环境敏感性且与不同类型EGFR具有不同亲和力
不难推测，由于是基于吉非替尼而进行设计，荧光探针HX103在与EGFR结合后同样会抑制EGFR磷酸化，进而抑制其下游信号通路，表明HX103用于预测EGFR-TKI治疗有效性是很有潜力的。
HX103在与EGFR结合后同样会抑制EGFR功能
研究人员进一步在含有不同EGFR突变的多种细胞系（H1975，HCC827，A549，A431，Hela，和MCF-7）中，评估了HX103与EGFR结合的特异性。
在这些细胞中，A431具有最高水平的EGFR表达，其次是H1975和HCC827细胞，而MCF-7细胞EGFR表达水平很低。而从EGFR激活水平看（EGFR磷酸化），HCC827细胞和H1975细胞中观察到最高水平的EGFR磷酸化，其次是PC9细胞和A431细胞。
这些细胞的EGFR突变情况则为：H1975细胞中约66%检测到的EGFR L858R表达，而在 HCC827细胞和PC-9细胞中分别约97%和86%检测到EGFR 19del表达，A431细胞、A549细胞和Hela细胞无EGFR激活突变。
HX103与这些细胞共同孵育后的荧光强度，与细胞EGFR激活水平和表达水平呈正相关，HCC827细胞、A431细胞和H1975细胞中显示出强荧光，A549细胞和Hela细胞中荧光较弱，HX103与EGFR阴性细胞——MCF-7的结合可忽略不计。这些结果表明了HX103可与EGFR特异性结合。
HX103与不同EGFR突变的多种细胞系的结合情况
接下来，研究人员在临床队列中评估了HX103荧光标记与EGFR突变状态的关系。总共46个临床样本（23个肿瘤组织及23个配对的癌旁组织）被纳入研究，这些样本均来自于NSCLC患者（腺癌）。
在进行检测前，研究人员首先使用抗CD45抗体去除组织中的淋巴细胞来减少探针的非特异标记，进而通过HX103和EGFR抗体进行多色荧光激活细胞分选来检测细胞EGFR表达阳性和HX103标记的比例。
在这些肿瘤样本中，12个肿瘤样本显示出高EGFR（+）HX103（+）比率，而1个具有高EGFR表达的肿瘤样本（#3）显示出低HX103标记，还有一个肿瘤标本显示出较少的EGFR表达（#8），但具有高HX103标记比例。
总的来看，HX103标记在NSCLC患者手术标本中区分野生型EGFR与EGFR激活突变时，总体一致性为82.6%，敏感性为81.8%，特异性为83.3%。这表明基于HX103的多色荧光激活细胞分选，可区分野生型EGFR与EGFR激活突变，虽然两者结果并不总是一致。
最后，研究人员评估了HX103用于预测EGFR-TKI疗效的作用，总共31例NSCLC患者被纳入研究，其中15例患者具有EGFR激活突变（L858R或19del）。在这些样本中，11/15（73.3%）的EGFR突变阳性样本显示EGFR（+）HX103（+），而16/16（100%）的EGFR突变阴性样本均不是EGFR（+）HX103（+）。
患者临床资料
在有完整数据的接受EGFR-TKI治疗的13例EGFR激活突变患者中，69.2%（9/13）取得客观反应（完全缓解或部分缓解），3例患者病情稳定，1例患者疾病进展[这4例患者均非EGFR（+）HX103（+）或HX103（+）]。
通过多色荧光激活细胞分选获得的EGFR（+）HX103（+）和HX103（+）数据，用于预测EGFR-TKI治疗效果的AUC值为1.0，特异性和敏感性均达到100%，而EGFR（+）的AUC值为0.81，敏感性和特异性分别为88.9%和75.0%。这一结果表明，基于HX103的多色荧光激活细胞分选可十分准确地预测患者对EGFR-TKI治疗的敏感性，但由于样本量较小，还需扩大样本量进行研究。
总的来说，该研究构建了可用于预测EGFR突变患者EGFR-TKI治疗有效性的荧光探针，预测效果优于目前通过检测突变DNA的常规预测方法，且更为经济、便捷，具有很强的临床实用价值。
1.Novello S: Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitors As Adjuvant Therapy in Completely Resected Non-Small-Cell Lung Cancer. J Clin Oncol 2015, 33(34):3985-3986.
2.Paez JG, Janne PA, Lee JC, Tracy S, Greulich H, Gabriel S, Herman P, Kaye FJ, Lindeman N, Boggon TJ et al: EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 2004, 304(5676):1497-1500.
3.NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines®)Non-Small Cell Lung Cancer Version 5.2022 — September 26, 2022
4.Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, Gurubhagavatula S, Okimoto RA, Brannigan BW, Harris PL, Haserlat SM, Supko JG, Haluska FG et al: Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med 2004, 350(21):2129-2139.
5.Deng H, Lei Q, Wang C, Wang Z, Chen H, Wang G, Yang N, Huang D, Yu Q, Yao M et al: A fluorogenic probe for predicting treatment response in non-small cell lung cancer with EGFR-activating mutations. Nat Commun 2022, 13(1):6944.
6.Robichaux JP, Le X, Vijayan RSK, Hicks JK, Heeke S, Elamin YY, Lin HY, Udagawa H, Skoulidis F, Tran H et al: Structure-based classification predicts drug response in EGFR-mutant NSCLC. Nature 2021, 597(7878):732-737.
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