徐医附院细胞研究和转化医学中心副主任
徐医附院血液科科副主任，淋巴瘤病区主任
中华医学会血液学分会淋巴细胞疾病学组委员
中国抗癌协会淋巴瘤专委会委员
中国EBV相关疾病工作组秘书长
中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会青年委员
中国抗癌协会血液肿瘤委员会慢淋工作组委员
中国抗癌协会第一届T细胞淋巴瘤工作组委员
中国老年医学会血液学分会淋巴瘤学组委员
江苏省淋巴瘤联盟副主席
江苏省医学会血液学分会淋巴瘤/骨髓瘤学组委员
江苏省“六大人才高峰”培养对象
江苏省“科教强卫工程”青年医学人才
徐州医科大学附属医院病理科，主管技师，博士
长三角地区临床病理质控联合体分子病理质控工作组委员
徐州市抗癌协会生物和转化治疗专业委员会常委
研究背景
弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一组常见的具有明显临床、病理和遗传特征异质性的B细胞淋巴瘤。CD5+DLBCL占所有DLBCL病例的5-10%，在临床上常具有更强的侵袭性和更差的预后。与CD5- DLBCL相比，CD5+D LBCL在老年患者中更常见，而且常常表现为结节外受累。更重要的是，CD5+DLBCL患者较难从基于利妥昔单抗的免疫化学疗法或干细胞移植中获益，用R-EPOCH（利妥昔单抗、依托泊苷、泼尼松、长春碱、环磷酰胺和多柔比星）治疗时，总生存期（OS）＜30个月。因此，探索CD5+DLBCL的新治疗策略是当务之急。
近年来，基于基因组测序的研究提出可从基因变异的角度对DLBCL进行分子分型。Schmitz等人于2018年提出，DLBCL病例被细分为以下四类：MCD（基于MYD88 L265P和CD79B突变的共同出现），BN2（基于BCL6融合和NOTCH2突变），EZB（基于EZH2突变和BCL2易位），N1（基于NOTCH1突变），以及 "其他 "亚型（无特定遗传特征）。其中MCD和N1亚型的患者相比于BN2和EZB亚型的患者的预后较差。该研究加深了对DLBCL分子遗传学的理解，同时提供了在线工具LymphGen为该分型方案的实际使用提供了具体的实用工具。
除此之外，基于基因表达谱（GEP）的研究也揭示了DLBCL在细胞起源（COO）上的异质性。根据细胞起源不同DLBCL被分为ABC型、GCB型和未分类型，其中ABC型预后较差。最近，基于NanoString平台的Lymph2Cx法被用于在福尔马林固定石蜡包埋组织中检测COO相关mRNA表达，这极大促进了COO分类的临床应用。
研究目的
以往针对CD5+的研究中发现，若干临床病理变量被确定为CD5+DLBCL的独立预测因素，包括年龄、国际预后指数（IPI）和MYC表达。此外，对细胞起源的研究表明，CD5+DLBCL病例主要是ABC亚型。然而，对于CD5+ DLBCL的临床病例研究还停留在表型层面，缺乏对分子遗传学分型的研究。此外，尚未有研究基于Lymph2Cx法检测CD5+ DLBCL病例的COO。本文旨在阐明CD5+DLBCL的分子特征和COO分型，并挖掘潜在的预后因素。
研究方法
本研究纳入了24例CD5+DLBCL和23例CD5-病例并收集临床病理特征信息。我们对这些病例进行了靶向DNA NGS测序，测序Panel包括475个淋巴瘤相关基因，并使用LymphGen工具对所有病例的分子亚型进行分类。采用Lymph2Cx法检测15个COO相关基因的mRNA表达量并进行COO分型。采用Kaplan-Meier法和Cox比例危险模型来挖掘与CD5+ DLBCL可能相关的预后因素。
结果
在被检测的475个基因中，近一半的CD5+DLBCL患者发现PIM1、MYD88和CD79B变异。其他常见于CD5+DLBCL的变异基因是KMT2D、BTG2、ETV6、HIST1H1E、TBL1XR1等（图1A）。CD5-DLBCL患者通常可见DUSP2、BCL6、SOCS1和TBLXR1变异。其他常见于CD5-DLBCL的变异基因是BTG2、CD79B、EBF1、MYD88、BTG1等（图1B）。CD5+和CD5-DLBCL具有较为相似的变异类型占比（图1C，D），而CD5+病例的拷贝数变异明显多于CD5-病例（2.4% vs 0.5%，P = 0.0377）。大多数基因变异都在CD5+和CD5-DLBCL中均可发现，只有7个基因在两组之间有明显的不同（表1）。
表1. CD5+/CD5-DLBCL 的遗传变异和分子分型差异
CD5+DLBCL更常见MYD88突变（62.5%，n = 15，P = 0.0189）、PIM1突变（66.7%，n = 16，P = 0. 0032）、KMT2D突变（41.7%，n = 10，P = 0.0173）和CDKN2A突变（23.8%，n = 5，P = 0.0496）。CD5-DLBCL更常见DUSP2突变（47.8%，n = 11，P = 0.0305）、TET2突变（17.4%，n = 4，P = 0.0496），以及BCL6重排（26.1%，n = 6，P = 0.048）。CD5+病例相比于CD5-病例有较高的药物敏感突变频率（图1E）。提示其可以从靶向治疗中获益，特别是基于PIM1激酶抑制剂、BTK抑制剂HDAC抑制剂的治疗。此外，与CD5-DLBCL相比，CD5+DLBCL显示出更高的染色体不稳定性（图2F），但肿瘤突变负荷没有任何明显的差异（图1G）。
图1. 基于DNA的靶向测序揭示了CD5+ DLBCL和CD5-DLBCL之间的基因差异。CD5+ DLBCL（A）和CD5- DLBCL（C）中最常见的基因变异具有显著的区别。CD5+ DLBCL(B)和CD5- DLBCL(D)的变异类型具有相似性。(E) 在CD5+DLBCL中，抑制剂敏感性变异更为常见。(F, G) 与CD5-DLBCL相比，CD5+DLBCL具有更高的染色体不稳定性，但肿瘤突变负荷无显著差异
我们根据Schmitz等人提出的分类器对所有CD5+和CD5-DLBCL病例进行分子分型。结果显示，MCD亚型占CD5+DLBCL病例的一半以上，明显高于CD5-DLBCL（54.17% vs. 13.04%，P = 0.005），而BN2（26.09% vs 4.17%，P > 0.05）和其他亚型（60.87% vs 37.5%，P > 0.05）主要见于CD5-DLBCL病例，但无统计学差异。
基于Lymph2Cx的COO研究显示，ABC亚型占CD5+DLBCL的62.5%（15/24），但仅占CD5-DLBCL的34.78%（8/23）。GCB亚型仅占CD5+DLBCL的12.5%（3/24）但在CD5-DLBCL中为60.87%（14/23）。此外，25.0%（6/24）的CD5+DLBCL和4.35%（1/23）的CD5-DLBCL为未分类型。这些结果表明，相对于CD5-DLBCL，CD5+DLBCL更常见ABC亚型（P = 0.0017）（图2）。
图2.基于Lymph2Cx法对（A）CD5+ DLBCL和（B）CD5- DLBCL的COO进行分类
我们分析了COO相关mRNA表达水平与DLBCL预后的关系。研究发现，Lymph2Cx法检测的15个COO相关mRNA中，有9个与DLBCL的预后相关。我们进一步分析这9个mRNA的表达水平在CD5阳性或阴性组中是否仍与预后相关，以确定这些mRNA是否是独立于CD5的预后相关因素。研究表明，CYB5R2的低表达提示了更好的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS），达到了CD5+组中CYB5R2低表达组的水平（P < 0.05）（图3B），表明CYB5R2是预后不良的一个独立因素。此外，MME（CD5+/MME高表达组）和SERPINA9（CD5+/SERPINA9高表达组）的高表达也提示了较好的预后（P < 0.05) （图3D，E）。
图3.COO相关mRNA表达水平与CD5+ DLBCL预后的相关性
最后，我们纳入了其它关键的临床病理学指标与mRNA表达共同进行多因素Cox分析，结果发现MYC/BCL2双表达（P = 0.040，HR = 4.951 [95% CI:1.078 - 22.741]）和ABC亚型（P = 0.039，HR = 7.430 [95% CI: 1.102 - 50.908]）是OS的独立预后不良因素。SERPINA9 mRNA高表达是OS的独立预后有利因素（P = 0.021，HR = 0.028 [95% CI: 0.001 – 0.583]），而MME mRNA高表达是OS（P = 0.002，HR = 0.038 [95% CI: 0.005 - 0.290]）和PFS（P = 0.003，HR = 0.156 [95% CI: 0.045 - 0.538]）的独立预后有利因素。
结论
CD5+DLBCL的基因特征是PIM1、MYD88和KMT2D突变，较常见MCD和ABC亚型。MYC/BCL2双重表达、ABC亚型、SERPINA9和MME的mRNA表达水平是CD5+DLBCL的独立预后因素。
作者：马东慎 桑威
单位：徐州医科大学附属医院血液科淋巴瘤中心
来源：Frontiers in oncology，2022
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