目前，多发性骨髓瘤(MM)仍是一种无法治愈的浆细胞恶性肿瘤。近年来，随着新药和新疗法的不断出现，MM治疗已取得显著进展。然而，由于耐药克隆的出现，几乎所有MM患者都终将面临复发难治的困境。近日，中国医学科学院血液学研究所郝牧研究员、邱录贵主任团队在eBioMedicine期刊发表了一篇题为“Indirubin-3’-monoxime acts as proteasome inhibitor:Therapeutic application in multiple myeloma”的研究论文。此研究首次发现并证实靛玉红衍生物Indirubin-3’-monoxime（I3MO）作为一种新型的蛋白酶体抑制剂（PI）在MM治疗中的新用途，可有效杀伤MM细胞，尤其在硼替佐米（BTZ）耐药的MM细胞中效果更为显著，并揭示其杀伤骨髓瘤细胞的分子机制及靶点。【肿瘤资讯】现特此整理，以飨读者。
本文要点
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I3MO在MM细胞中具有良好的细胞毒性
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I3MO使MM细胞对硼替佐米诱导的细胞凋亡敏感
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I3MO是骨髓瘤细胞凋亡的多方面调节因子
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I3MO通过下调USP7表达抑制MM细胞的生长
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敲降PSME3和PSME4可抑制MM细胞生长并对硼替佐米诱导敏感
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高水平PSME3或PSME4与MM患者预后较差相关
研究背景
骨髓瘤细胞可产生大量副蛋白（又称M蛋白），其降解和维持细胞内稳态在很大程度上依赖于未折叠蛋白反应(UPR)和泛素-蛋白酶体系统(UPS)。UPS是一种通过蛋白酶体全酶、泛素连接酶和去泛素化(DUB)酶介导的非溶酶体细胞内蛋白质降解途径。UPS通路的去调节与各种人类疾病的发病机制有关，包括MM。既往研究表明，DUB过表达也在硼替佐米耐药性中起关键作用。抑制DUB，如泛素特异性蛋白酶-7(USP7)，可显著引起蛋白质超负荷，从而促进细胞凋亡并克服MM细胞中的硼替佐米耐药性。
PI作为MM代表性治疗药物之一，极大改善了大多数新诊断多发性骨髓瘤(NDMM)患者的预后。其作用机制是通过干扰蛋白酶体负荷和能力之间的平衡。然而，临床治疗中持续暴露于PI可诱导患者出现耐药性。耐药的分子机制尚未被完全阐明，几项研究发现，单点突变和20S蛋白酶体亚基的亚基PSMB5的持续过表达在MM细胞的PI耐药性中起关键作用。蛋白酶体复合物主要由20S催化核心蛋白酶体颗粒、19S亚基调节因子和11S替代激活剂组成。最近的研究表明，抑制19S蛋白酶体相关泛素受体Rpn13可有效诱导MM细胞凋亡并克服硼替佐米耐药性。PA28(11S，REG)是蛋白酶体调节因子家族，其成员广泛存在于许多真核超类群中。PA28γ(PSME3)可显著增强20S蛋白酶体对靶蛋白的降解。PA200(PSME4)是另一种200 kDa大的单体蛋白酶体激活剂，可与20S蛋白酶体结合并调节乙酰基-组蛋白的降解。
在本研究中，研究者评估了I3MO对MM细胞杀伤的有效性和作用机制。研究结果支持I3MO是一种有效的治疗PI耐药MM的药物，这为临床应用I3MO作为蛋白酶体抑制剂治疗MM提供了合理的证据。
研究结果
I3MO在MM细胞中具有良好的细胞毒性
为了确定I3MO对MM细胞的杀伤作用，研究者使用一组MM细胞系和患者原代细胞样本进行了体外和体内研究。研究发现I3MO显著抑制了MM细胞的生长，且显著降低了MM细胞系（ARP1、U266和RPMI8226）的活性并呈剂量依赖性降低（图1a）。有趣的是，研究者还发现I3MO也抑制耐药性MM细胞的生长，包括常规治疗药物如多柔比星(RPMI8226-DOX40)、地塞米松(MM.1R)和硼替佐米(ANBL6-BR)的耐药性（图1b和1c）。值得注意的是，与原代细胞相比，对BTZ耐药的MM细胞对I3MO更敏感（P<0.001，图1c）。
为进一步证实I3MO对MM细胞的杀伤作用，研究者对患者原代细胞样本进行了检查。与未处理组相比，I3MO诱导患者原代CD138 +细胞活力呈剂量依赖性抑制（P<0.05，图1d）。此外，I3MO治疗(5μM)对正常外周血单核细胞（PBMC，数据未显示）未显示显著的细胞毒性，这表明对正常细胞，I3MO具有良好的治疗特异性和无细胞毒性。
进一步研究肿瘤相关微环境(TAM)是否抑制I3MO对MM细胞的杀伤作用，流式细胞术数据显示，即使在存在基质细胞的情况下，I3MO也可显著抑制CD45lowCD138 + MM细胞的生长和存活（图1e）。5μM或10μM I3MO处理72h后，细胞活力分别降至(78.41±12.65)%和(66.57±14.50)%（n=7，P<0.05，图1f）。更重要的是，I3MO治疗可以抑制对BTZ显著耐药的RRMM患者骨髓单核细胞(BMNCs)的存活。研究数据显示，I3MO治疗显著抑制了RRMM患者中CD45lowCD138 + MM细胞的生长（n=4，P<0.0001，图1g）。总之，这些结果表明，在野生型和耐药MM细胞中，I3MO均是抗MM细胞的有效细胞毒性药物。而且，即使在肿瘤相关微环境(TAM)的保护下，I3MO也能抑制MM细胞存活。
图1 I3MO对MM细胞生长的细胞毒性作用
接下来，研究者确定了I3MO对MM细胞周期和凋亡诱导的影响。流式细胞仪分析显示，I3MO治疗可有效引起药物敏感的ARP1、U266、RPMI8266、ANBL6和硼替佐米耐药的ANBL6-BR细胞系中MM细胞的细胞周期阻滞（图2a）。由于背景不同（细胞遗传学和生物学异质性），MM细胞系中的细胞周期停滞表现不同，研究者在U266、RPMI8226、ANBL6和ANBL6 BR MM细胞中发现G2/M期阻滞。此外，5种MM细胞系的S期均显著降低，尤其是高剂量组。值得注意的是，I3MO处理触发了MM细胞的显著凋亡（图2b），这与蛋白PARP和半胱天冬酶3裂解相关，如图2c所示。
图2 I3MO诱导MM细胞凋亡
由于I3MO对BTZ敏感和BTZ耐药的MM细胞均有细胞毒作用，可进一步探索I3MO和BTZ在骨髓瘤的治疗中是否具有协同效应。数据显示，I3MO显著增强MM细胞对硼替佐米诱导的细胞凋亡的敏感性。I3MO和BTZ在野生型和BTZ耐药细胞中均表现出协同效应（图3a）。
研究者进一步利用两种不同的体内策略来解决I3MO抗MM疗效，并证实了I3MO和硼替佐米的联合抗MM活性。
首先，根据异种移植骨髓瘤小鼠模型研究数据，较低剂量联合治疗的肿瘤抑制作用与I3MO或BTZ常规治疗相当（图3b）。此外，为了确定I3MO治疗的毒性，研究者监测了I3MO治疗期间Balb/c小鼠的白细胞(WBC)量和体重。结果表明，I3MO治疗没有明显的血液学毒性和体重减轻，这支持了I3MO良好的耐受性和有效的抗MM作用。降低I3MO和BTZ剂量的联合治疗可能有益于临床实践，并减轻药物诱导的副作用。
为了研究I3MO在体内对原代MM患者细胞的影响，研究者使用斑马鱼异种移植(PDX)模型作进一步研究。如图3c-e所示，I3MO单药或联合治疗均可消除MM细胞在斑马鱼胚胎中的植入（P<0.05，t检验）。总之，这些体外和体内结果证实了I3MO诱导有效诱导的抗MM活性，并显著增强了硼替佐米联合治疗的细胞毒性。
图3 I3MO使MM细胞对硼替佐米诱导的细胞凋亡敏感
I3MO是骨髓瘤细胞凋亡的多方面调节因子
根据KEGG分析，用或不用I3MO治疗的MM细胞系中的差异表达基因(DEGs)通常富集在多个通路中，包括泛素介导的蛋白水解、细胞周期、蛋白酶体和凋亡通路，I3MO显著诱导MM细胞系细胞周期阻滞和凋亡。此外，基因集富集分析(GSEA)数据显示，在Ub特异性加工蛋白酶体途径中，I3MO诱导的这些MM细胞系中的DEG被显著抑制。值得注意的是，I3MO处理后，MM细胞系中UPP相关基因显著下调，包括USP7、USP11、USP13等。这说明I3MO是细胞凋亡的多方面调节因子。Ub特异性加工蛋白酶体途径是I3MO抗MM作用的共同机制。
为证实介导I3MO抗MM活性的信号通路，研究者进一步分析了5种MM细胞系（ARP1、U266、RPMI8266、ANBL6和ANBL6 BR）。使用Western印迹法，研究数据显示I3MO下调的USP7触发p53和p65降解，抑制其下游信号转导。既往研究表明，USP7/NEK2/nfkb通路的激活在MM的硼替佐米耐药性中起关键作用。由于USP7对NEK2的稳定是p65释放到细胞核中所必需的，进一步研究USP7的下调是否通过触发NEK2降解和抑制其下游信号转导参与I3MO的功效。Western印迹显示，I3MO触发USP7和NEK2的表达下降。进一步研究抑制I3MO处理引发的NF-kB是否可以克服硼替佐米耐药性，发现I3MO也引起NEK2-OE硼替佐米耐药MM细胞活力呈剂量依赖性降低（P<0.001）。进行细胞核和细胞质分馏，以确定I3MO处理后p65是否稳定在细胞核中。与EV对照细胞相比，NEK2-OE硼替佐米耐药MM细胞细胞质和细胞核组分中p65的蛋白水平均增加。一致地，I3MO处理后NEK2和p65的细胞质和细胞核积累均被逆转，表明I3MO通过下调USP7损害了NEK2和p65的稳定性。总之，研究数据表明，I3MO下调USP7的水平并促进NEK2降解，导致下游靶标和NF-kB信号的抑制，并诱导硼替佐米耐药MM细胞的细胞死亡。这些发现也表明I3MO的抗MM活性与USP7减少有关，其下游靶点p53和NF-kB通路。这些结果进一步支持Ub特异性加工蛋白酶途径（UPP途径）是I3MO的潜在靶点。
GSEA分析表明I3MO影响蛋白酶体活性。因此，为了进一步验证I3MO对蛋白酶体活性的影响，研究者分析了ARP1、U266和ANBL6 BR MM细胞系。在I3MO处理的药物敏感(ARP1、U266)和硼替佐米耐药(ANBL6 BR)MM细胞系中，观察到蛋白酶体活性降低，即糜蛋白酶样(CT-L)和半胱天冬酶样(C-L)。此外，与硼替佐米或I3MO单独给药相比，I3MO和硼替佐米联合给药进一步降低了CT-L和C-L蛋白酶体活性。
RNA-seq数据显示，在ANBL6 BR骨髓瘤细胞中，I3MO处理(5 μM，24h)调节了42个蛋白酶复合体基因，包括34个下调基因和7个上调基因，PSMB11无差异。研究者接下来评估了I3MO处理后PSME3和PSME4在MM细胞存活中的功能。实时PCR数据证实，5 μM I3MO过夜处理的ARP1、ANBL6和ANBL6 BR MM细胞系中PSME3和PSME4水平降低（P<0.05，t检验）。蛋白质印迹证实，在药物敏感的ARP1、U266和硼替佐米耐药的ANBL6 BR MM细胞系中，PA28g和PA200的蛋白水平均下调。总之，这些发现支持I3MO作为蛋白酶体抑制剂靶向蛋白酶体亚单位PSME3和PSME4的观点。
敲降PSME3和PSME4可抑制MM细胞生长并对硼替佐米诱导敏感
研究者评估了PSME3和PSME4是否对MM细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性有影响。细胞活力分析显示，当敲降PSME3或PSME4时，MM细胞对硼替佐米诱导的细胞生长停滞更敏感，尤其是在硼替佐米耐药细胞ANBL6-BR中（图4a和4b）。在ARP1和ANBL6 BR细胞系中，敲降PSME3和PSME4显著增加了硼替佐米诱导的MM细胞凋亡（图4c和d）。
为了更好地理解PSME3和PSME4对硼替佐米诱导MM细胞凋亡敏感的机制，分析了敲降PSME3或PSME4 ARP1和ANBL6 BR MM细胞系中蛋白质合成的能力。发现当PSME3或PSME4下调时，ARP1细胞中的k轻链合成或ANBL6 BR细胞中的λ轻链显著增加（图4e和f）。此外，敲降PSME3或PSME4显著降低MM细胞对I3MO的敏感性（图4g和h）。这些结果表明，I3MO通过干扰蛋白酶体负荷和能力之间的平衡对MM的疗效。硼替佐米耐药情况下的PSME3和PSME4代表了有前景的潜在治疗靶点。
图4 敲除PSME3和PSME4可显著增强骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性
基于MM患者的公开GEO数据集(GSE5900&GSE2658)，发现新诊断MM患者(NDMM，n=351)的浆细胞中PSME3(200987_x_at)和PSME4(212219_x_at)的水平显著升高。当PSME3和PSME4 affgli信号的临界值设定为1,000时，与健康供体的浆细胞相比，351例NDMM患者中分别有134例(38.2%，PSME3)和123例(35.0%，PSME4)表现出PSME3和PSME4水平显著升高。值得注意的是，RRMM患者的PSME3和PSME4水平进一步升高（P<0.05，t检验）。
CCLE转录组数据集还显示，相对于其他血液恶性肿瘤和实体瘤，包括MM在内的B细胞来源的恶性肿瘤中PSME3和PSME4的水平显著增高。为了证实PSME3或PSME4在蛋白水平上调，研究者检测了NDMM和RRMM的主要患者样本。蛋白质印迹显示，NDMM患者中PA28g(PSME3)和PA200(PSME4)的蛋白水平升高，与正常浆细胞相比，RRMM中进一步上调。相对于正常浆细胞，一组MM细胞系中PA28g和PA200显著增加。Kaplan-Meier分析显示，使用R包在最佳表达信号截止时高度PA28g(PSME3)或PA200(PSME4)的MM患者预后较差。在MMRF-CoMMpass临床试验中，PSME3表达升高的MM患者中共有12.0%患者的总生存期(OS)较差（HR=3.045，P<0.0001）。在MMRF-CoMMpass临床试验中，37.0%(326/858)PSME4表达升高的MM患者的总生存期(OS)较差（HR=1.507，P=0.0037）。总之，这些结果表明PA28g(PSME3)和PA200(PSME4)在RRMM中发挥关键作用，因此可作为具有前景的治疗靶点。
研究讨论
靛玉红是来源于中药传统方剂青黛的许多活性成分之一，20世纪70年代中期由中国医学科学院血液学研究所的研究员发现。靛玉红-30-单肟(I3MO)是靛玉红的理想衍生物之一，与靛玉红本身相比，IC50较低，细胞毒性增强。多项研究报道，I3MO在血液系统恶性肿瘤和实体瘤中有效诱导恶性细胞凋亡，抑制细胞周期蛋白依赖性激酶，触发抗血管生成作用。
在本报告中，体外和体内研究证明了I3MO能有效抑制MM细胞生长，即使在保护性肿瘤相关微环境(TAM)存在的情况下也是如此。值得注意的是，I3MO与硼替佐米联合可显著增强MM细胞对硼替佐米诱导的细胞凋亡的敏感性。I3MO作为MM细胞死亡的多方面调节因子，促进细胞周期阻滞、DNA损伤反应，高效诱导肿瘤细胞凋亡。此外，I3MO还通过下调USP7的表达抑制NF-kB信号，NF-kB信号是介导MM细胞生长和耐药的关键通路。
本研究还表明蛋白酶体亚单位PA28γ和PA200是I3MO直接的作用靶点。因此，I3MO作为蛋白酶体抑制剂，有可能通过靶向PA28g(PSME3)和PA200(PSME4)克服MM细胞中的硼替佐米耐药性，因此具有与传统蛋白酶体抑制剂硼替佐米相比的不同作用机制。通过shRNA敲降PSME3或PSME4不仅抑制蛋白酶体活性，而且增加蛋白合成，进而导致细胞生长停滞，增加MM细胞对传统蛋白酶体抑制剂硼替佐米的敏感性。MM细胞对硼替佐米的敏感性在很大程度上取决于蛋白酶体负荷和能力之间的平衡。某些MM细胞系对BTZ的敏感性可能源于蛋白酶体能力降低、蛋白酶体工作负荷增加或两者兼有。本研究结果表明，I3MO下调PSME3或PSME4可降低蛋白酶体能力，并通过增加MM细胞中的蛋白质合成显著增加蛋白酶体工作负荷。而且，敲降PSME3或PSME4显著降低MM细胞对I3MO的敏感性。这些发现表明，I3MO靶向PSME3/4，促进对BTZ敏感的MM细胞。
研究结果证实靶向蛋白酶体激活剂PSME3(PA28g)和PSME4(PA200)的组分引起替代蛋白酶体功能的抑制，并有效诱导MM细胞生长的抑制。通过对连续MM样本的系统分析表明，NEK2标记的增加与MM的耐药性有关。本研究证明了I3MO通过下调蛋白酶体激活剂PA28g和PA200有效地抑制NEK2过表达MM细胞的细胞生长。利用公开的数据集，可以发现超过30%的MM患者PSME3和PSME4水平升高，尤其是在RRMM中。此外，高水平PSME3或PSME4与MM患者的不良预后相关。所有这些发现均支持PSME3和PSME4组成的替代蛋白酶体在MM生长和进展中的关键作用，尤其是在硼替佐米耐药MM中。
RRMM患者中PSME3和PSME4的表达增加代表了耐药性克隆的生物标志物。I3MO靶向PA28g(PSME3)和PA200(PSME4)，导致下游信号失活，从而导致细胞死亡，克服MM细胞的耐药性。由于上述蛋白酶体复合物的不同靶标，I3MO对硼替佐米耐药MM细胞发挥治疗作用，并增强硼替佐米联合治疗的细胞毒性。这些发现强调了PSME3和PSME4抑制在使MM对PI敏感或克服PI耐药方面的潜在价值。
研究总结
研究首次报道了，I3MO通过抑制蛋白酶体活性，降低去泛素化酶表达，增加MM细胞蛋白质载量，导致MM细胞蛋白稳态失衡，从而诱发MM细胞凋亡，抑制MM细胞存活。同时发现BTZ与I3MO联合应用可协同抑制MM细胞系及MM患者原代肿瘤细胞的生长。进一步应用异种移植小鼠模型和新型MM-PDX斑马鱼模型，证实了低剂量BTZ和I3MO联合治疗均能显著抑制骨髓瘤细胞的生长，达到BTZ常规剂量的治疗效果，起到减毒增效的作用。在深入的机制研究中，研究者发现I3MO可有效抑制MM细胞糜蛋白酶样和半胱天冬酶样蛋白酶体活性，是一种新型的蛋白酶体抑制剂。I3MO可显著下调MM细胞蛋白酶体亚单位PA28γ（PSME3）和PA200（PSME4）的mRNA及蛋白质表达水平。进一步研究证实蛋白酶体亚单位PA28γ和PA200是I3MO直接的作用靶点，这一靶点与BTZ等蛋白酶体抑制剂的作用靶点完全不同。
临床MM患者GEO数据集分析结果显示，在MM患者细胞中，I3MO作用靶点PSME3和PSME4均过度表达，其表达水平与MM细胞的复发耐药性相关。Kaplan-Meier生存分析显示，PSME3或PSME4高水平表达的患者生存期显著缩短，患者预后差。敲降PSME3或PSME4的水平可显著抑制MM细胞的生长，提高MM细胞对BTZ的敏感性。体内研究也证实，下调PSME3或PSME4的水平可以抑制MM细胞在小鼠体内的增殖，延长荷瘤MM小鼠的存活时间。该结果提示临床上对硼替佐米治疗不敏感甚至耐药的患者，I3MO依然可获得较理想的治疗效果，将为RRMM患者的治疗提供新的策略。
此研究结果阐明了靛玉红衍生物I3MO是一种新型的蛋白酶体抑制剂，为临床应用I3MO治疗MM，尤其是RRMM提供了实验和理论依据，为后续靛玉红衍生物的结构优化及药物研发奠定了坚实的实验基础。
Zhang T, Liu H, Jiao L, et al.Genetic characteristics involving the PD-1/PD-L1/L2 and CD73/A2aR axes and the immunosuppressive microenvironment in DLBCL.Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2022;10:e004114. doi: 10.1136/jitc-2021-004114
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