蔡洁媛a ，董凤晓a翻译；王正航a,b 审校
a北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科；b中国临床肿瘤学会（CSCO）翻译小组
原文出处: Shitara, K. et al. Molecular determinants of clinical outcomes with pembrolizumab versus paclitaxel in a randomized, open-label, phase III trial in patients with gastroesophageal adenocarcinoma☆. Annals of Oncology 32, 1127–1136 (2021).
本文将特邀肿瘤学年鉴中文版编委、华中科技大学附属协和医院刘红利教授进行解读与点评，敬请继续关注。
摘要
背景：在III期试验KEYNOTE-061（NCT02370498）中，二线使用帕博利珠单抗治疗PD-L1联合评分（CPS）≥1的胃/胃食管结合部腺癌并未比紫杉醇显著提高患者的总生存期。本研究确定了组织的肿瘤突变负荷（tissue tumor mutational burden，tTMB）与临床结局的关系，也探索了tTMB与CPS以及微卫星高度不稳定（microsatellite instability-high，MSI-H）状态之间的关系。
患者和方法：在具有全外显子测序（WES）数据的患者中[420/592（71%）；帕博利珠单抗218例；紫杉醇202例]，tTMB与客观缓解率（逻辑回归），无进展生存期（PFS；Cox风险比例回归），以及总生存期（OS；Cox风险比例回归）的关系使用单侧（帕博利珠单抗）和双侧（紫杉醇）P值评估。tTMB还使用了FoundationOne®CDx 进行评估[205/592（35%）]。预先设定WES测得175mut/exome和FoundationOne®CDx 测得10mut/Mb为阈值。
结果：单因素分析显示，WES-tTMB在帕博利珠单抗组与ORR、PFS以及OS显著相关（所有P＜0.001），但是在紫杉醇组与ORR、PFS和OS不显著相关（所有P＞0.6）。单因素分析中，帕博利珠单抗组的WES-tTMB与应答的ROC曲线下面积为0.68 [95% CI：0.56-0.81]，紫杉醇组为0.51（95% CI：0.39-0.63）。在两组中WES-tTMB与CPS之间的相关性较低（r≤0.16）。在使用CPS校正后，WES-tTMB仍然与帕博利珠单抗治疗后的所有临床结局显著相关；在排除已知MSI-H的肿瘤（n=26）后，WES-tTMB与PFS和OS仍显著相关。FoundationOne®CDx-tTMB显示帕博利珠单抗组中tTMB与ORR、PFS和OS呈显著相关（所有P≤0.003），但是紫杉醇组中tTMB与PFS或OS均无显著相关性（P＞0.1）。
结论：来自KEYNOTE-061的探索性分析，首次在随机对照试验的背景下证实了tTMB与帕博利珠单抗治疗胃/胃食管结合部腺癌的疗效呈显著相关性，与紫杉醇无相关性。这些数据还说明tTMB是除PD-L1状态之外的一个显著且独立的疗效预测因子。
引言
尽管治疗方案不断进步，进展期胃癌的预后仍然较差。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）基于DNA或RNA特征，将胃癌分为四种分子亚型：微卫星不稳定型（microsatellite instability，MSI），EB病毒（EpsteineBarr virus，EBV）阳性型，基因组稳定（genomically stable，GS）型，以及染色体不稳定型（chromosomal instability，CIN）。尽管MSI-H的肿瘤与较高的肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）有关，但也有些胃癌患者是微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）且TMB较高。高度突变的肿瘤更倾向于表达新抗原，从而使其成为活化的免疫细胞的靶点。尽管有研究表明在肺癌中TMB和联合免疫治疗的疗效并无确切关系，但有证据表明TMB和新抗原负荷仍是与免疫检查点抑制剂（ICI）的反应相关的具有应用前景的分子标志物。因此，在接受ICI治疗的胃癌患者中仍需要探索TMB的价值。
基于II期KEYNOTE-059试验队列1的数据，美国加速批准了帕博利珠单抗应用于PD-L1阳性（联合肿瘤评分CPS＞1）的局部进展期或转移性胃/胃食管联合部（GEJ）腺癌≥2线治疗失败后的患者。在不可切除或转移性MSI-H或错配修复缺陷的实体瘤治疗进展后，帕博利珠单抗的应用也得到了加速审批。
KEYNOTE-061（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT02370498）是一项随机、开放标签的III期临床试验，比较二线使用帕博利珠单抗和紫杉醇治疗胃/胃食管结合部腺癌的疗效。最初，无论PD-L1 状态如何，均可入组；但后续的入组仅限于肿瘤表达CPS≥1的患者。对主要分析人群（CPS ≥1）的双重主要终点的分析显示，与紫杉醇相比，帕博利珠单抗的总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）并未显著延长。然而，帕博利珠单抗比紫杉醇具有更持续的应答和更优的安全性。另外，事后分析提示在PD-L1 CPS≥10的患者中，帕博利珠单抗治疗（n=53）比紫杉醇治疗（n=55）的患者有更长的OS、更高的反应率和更持续的应答。然而，帕博利珠单抗未被批准用于晚期胃/GEJ 腺癌的二线治疗。在方案既定的CPS＜1的亚组分析中，帕博利珠单抗相对于紫杉醇的风险比（hazard ratio，HR）为1.2（OS）和2.05（PFS）。Kaplan-Meier 曲线在CPS≥1人群中的交叉现象强调了分析其他生物标志物的重要性。最近，一项针对胃癌的小型研究表明，MSI-H、EBV 阳性和高组织TMB （tissue TMB，tTMB）与帕博利珠单抗的高应答率相关。本文对KEYNOTE-061进行探索性分析，评估了tTMB与PD-L1和MSI-H的相关性，以及这些标志物与接受二线帕博利珠单抗或紫杉醇治疗的进展期胃/GEJ癌患者的临床结局的关系。
患者和方法
试验设计和受试者
这项III期KEYNOTE-061试验在30个国家的148个医疗中心开展；研究细节已有报道。符合标准的患者为转移性或不可切除的局部进展期胃/胃食管结合部腺癌，一线使用以铂类和氟尿嘧啶类为基础的治疗后进展。患者以1：1随机分为2组：帕博利珠单抗200 mg静脉注射，每3周一次（Q3W），共35周期；或紫杉醇80 mg/m²静脉注射，以4周为一周期，在每个周期的第1、8和15天给药，直至疾病进展或发生不可耐受的毒副作用，亦或是医生决定停药或患者撤销知情同意。
该研究方案和所有更新均获得了每个机构的机构审查委员会或伦理委员会的批准。患者在入组前签署了知情同意书。该研究根据试验方案及其更新，以及药品临床试验管理规范进行。
步骤
每6周进行一次（Q6W）影像学检查。根据RECIST v 1.1进行盲法独立中央审查评估疗效。
在中心实验室使用PD-L1 IHC 22C3 pharmDx（Agilent, Santa Clara, CA）检测CPS，来评估存档的或新收集的肿瘤样本中的PD-L1表达，CPS计算方法为：PD-L1 染色细胞（肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞）除以存活的肿瘤细胞总数，再乘以100。从福尔马林固定、石蜡包埋的（formalin-fixed, paraffin-embedded，FFPE）肿瘤样本及外周血样本（正常对照）中提取DNA，使用MSI分析系统1.2版本（Promega, Madison，WI）检测5个单核苷酸重复序列（NR21、NR24、BAT25、BAT26以及MONO27）的DNA错配修复情况。与正常对照相比，≥2个序列改变则认为肿瘤存在高度微卫星不稳定。tTMB使用全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）和FoundationOne®CDx （Foundation Medicine，Cambridge，MA）进行检测。EBV、CIN 和 GS 的亚组分析基于先前描述的基于DNA 测序的基因组学分类。
对于WES分析，71%（420/592）肿瘤组织和匹配的正常血液样本按照先前的描述进行分析。使用长读Burrows-Wheeler校正算法（BWA-MEM）将WES结果与相应的人基因组GRCh37比对。该过程[使用Picard v1.114和Genome Analysis Toolkit,v2进行重复标记、插入和缺失（indel）重新对齐以及碱基重新校准]的实施是为了生成肿瘤和配对正常样本的分析就绪数据BAM文件，使用MuTect，将它们进行对比来生成体细胞单核苷酸变异（single nucleotide variant，SNV）。如果某一SNV出现在单核苷酸多态性数据库 （dbSNP, v141）中，但不在癌症体细胞突变目录（COSMIC, v68）中，或者肿瘤样本中该突变的读数＜4，则将其排除。WES-tTMB被定义为每位患者符合所有描述标准的所有体细胞非同义SNV的总和。
FoundationOne®CDx是一种基于二代测序（next-generation sequencing，NGS）的体外诊断手段，可以检测到碱基替换、插入改变、拷贝数改变、特定的基因重排以及基因组特征，包括MSI和TMB。使用FoundationOne®CDx v3.3.8和v3.3.9，从205/592（35%）例FFPE肿瘤组织标本中分离DNA，通过在涵盖了324个基因的0.8Mb的区域内计数同义和非同义突变的总和，并且基于生信算法过滤掉胚系突变以及体系的驱动致癌突变，最终计算FoundationOne®CDx-tTMB，结果单位为mut/Mb。
终点
在这项探索性分析中，预先设定的主要目标包括：评估WES-tTMB（作为一个log10-转换的连续变量）是否与帕博利珠单抗或紫杉醇更好的临床疗效相关，评估帕博利珠单抗相较于紫杉醇在WES-tTMB高与不高（阈值预设为175mut/exome）的亚组中的相对治疗效果，以及在TCGA分类的四种亚型（MSI、EBV、CIN和GS）中使用帕博利珠单抗相较于紫杉醇的临床应答。次要目标为：比较tTMB阈值取175mut/exome和CPS阈值取10或1时的临床实用性，从而在多变量模型中分别评估WES-tTMB和CPS（分别作为log10-和平方根转换的连续变量）是否为帕博利珠单抗和紫杉醇应答的独立预测因子；并且在非MSI-H亚组（定义为MSS或MSI状态未知）中分别评估WES-tTMB是否与帕博利珠单抗和紫杉醇的临床疗效相关。本研究还进行了Foundation®OneCDx-tTMB的评估。
统计学分析
该探索性分析包括了所有治疗的患者，无论其PD-L1状态如何，只要可获得质控过关的WES-tTMB和/或Foundation®OneCDx-tTMB数据即可。在融合临床以及tTMB探索性标记物数据之前即完成了统计分析计划，该计划列出了在何种情况下进行统计分析，并在帕博利珠单抗和紫杉醇疗效对比中提前确定了用来区分亚组的tTMB阈值。tTMB的终点在融合tTMB和临床数据之前已经确定。根据这一计划进行分析；因此，tTMB数据对于治疗组和临床结局而言是未知的。
该探索性的WES-tTMB阈值（≥175mut/exome）在其他多个瘤种中也被WES平台确定为合适的阈值。与FoundationOne®CDx的阈值为10mut/Mb一致性最高的WES-TMB评分是通过以下方式确定的：在多项研究、多个瘤种的患者队列中[n=338（不包括 KEYNOTE-061 的患者样本），同时使用这两种平台检测TMB，找到与FoundationOne®CDx 10mut/Mb的阈值具有平均最大的阳性和阴性一致性的WES阈值。
对于探索tTMB与临床获益的联系，使用逻辑回归和Cox风险比例生存回归模型计算单侧（帕博利珠单抗；假设正相关）和双侧（紫杉醇；没有假设倾向）的P值，使用东部肿瘤合作组（ECOG）状态评分进行校正。没有进行模型选择。使用预先定义的tTMB阈值（WES，175 mut/exome组；Foundation®OneCDx，10 mut/Mb）将患者分为两组，进一步基于预先设定的亚组分析来评估这些亚组中帕博利珠单抗与紫杉醇的疗效，从而了解tTMB潜在的临床用途。在每个亚组内，使用Cox风险比例回归模型来估计帕博利珠单抗对比紫杉醇的HR和95%可信区间（confidence interval，CI）。缺失的 tTMB 和 PD-L1 数据被假定为随机缺失。模型在“完整案例”中运行。
该分析的临床数据截止日期为 2017 年 10 月 26 日。
从2015年6月4日到2016年7月26日共有592例患者随机接受帕博利珠单抗或紫杉醇治疗。KEYNOTE-061全人群的中位随访时间是7.9个月（四分位间距是3.4-14.6个月），其中420例（帕博利珠单抗组218例，紫杉醇组202例）患者有WES-tTMB数据，纳入最终分析。WES-tTMB分析的人群基线特征与试验总体入组人群的基线特征相似，其内部两个治疗亚组之间基线特征均衡。
表1. 帕博利珠单抗与紫杉醇组中，WES-tTMB（取对数log10）与缓解率、PFS和OS的相关性P值
在帕博利珠单抗组，WES-tTMB（log10转换的连续变量）和临床结局显著相关（单侧P < 0.001）（表1，图1）；这些数据包括了MSI-H和PD-L1阳性肿瘤。相反，在紫杉醇组WES-tTMB和临床结局无显著的相关性（双侧P > 0.6）（表1，图1）。通过CPS校正后，在帕博利珠单抗组WES-tTMB仍然与临床结局具有显著的相关性，这意味着WES-tTMB是帕博利珠单抗临床获益的独立预测因子；这些数据包括了MSI-H肿瘤。在紫杉醇治疗的全人群和非MSI-H人群中，不论是WES-tTMB还是CPS都与临床反应无关。
图1. WES-tTMB（取对数log10）与缓解率、治疗分组的箱形图，注明了患者的MSI-H状态。
MSI-H人群（n=26）的WES-tTMB值最高，其中24例检测值大于175mut/exome。EBV、CIN和GS状态与疗效无关。
帕博利珠单抗治疗组中，对418例有WES-tTMB和CPS数据的患者进行分析，WES-tTMB识别客观缓解的ROC曲线下面积是0.68（95% CI：0.56-0.81），CPS的ROC曲线下面积是0.70（95% CI：0.61-0.80）。当剔除已知MSI-H的患者后再分析，WES-tTMB和CPS的ROC曲线下面积分别降到0.61（95% CI：0.47-0.76）和0.67（95% CI：0.56-0.77）。WES-tTMB和CPS二者之间几乎没有关联（r≤ 0.16）（图2）。
当评估WES-tTMB的临床应用价值时，在WES-tTMB≥175 mut/exome 亚组中，帕博利珠单抗治疗可以带来生存获益（表2，图3）。在WES-tTMB≥175 mut/exome 亚组中，帕博利珠单抗对比紫杉醇的OS的HR为0.46（95% CI：0.27-0.81），在WES-tTMB＜175 mut/exome 亚组中为1.12（95% CI ：0.89-1.41）。在WES分析人群中评估CPS的临床效用时，在CPS≥1和CPS≥10的两个亚组中均观察到了帕博利珠单抗的OS获益趋势。当取1为阈值时，帕博利珠单抗对比紫杉醇的OS的HR在CPS≥1亚组中为0.82（95% CI：0.63-1.06），在CPS＜1的亚组中为1.27（95% CI：0.89-1.83）。当取10为阈值时，帕博利珠单抗对比紫杉醇的OS的HR在CPS≥10亚组中为0.63（95% CI：0.38-1.06），在CPS＜10的亚组中为1.03（95% CI：0.82-1.30）。WES分析人群中CPS亚组的OS的HR值与研究总人群一致。在MSI-H和非MSI-H人群中的双重生物标记物（tTMB 和PD-L1）亚组分析详见表3；这仅仅是一项探索性分析，其样本量较少。
排除已知MSI-H的患者后，在帕博利珠单抗组中，WES-tTMB与PFS和OS显著相关（表4，图4）。在WES-tTMB≥175 mut/exome 亚组中，当把MSI-H患者排除后，帕博利珠单抗vs 紫杉醇治疗的OS的HR从0.46（95% CI：0.27-0.81）上升至0.60（95% CI：0.31-1.16）。
对通过Foundation®One进行Foundation®OneCDx-tTMB检测的样本进行分析（帕博利珠单抗n=109；紫杉醇n=96），帕博利珠单抗组中，Foundation®OneCDx-tTMB与ORR（P<0.0006；AUROC=0.68），PFS（P < 0.0001）和OS（P=0.0031）均显著相关；这些数据包含MSI-H人群和PD-L1阳性人群。但是在紫杉醇组中，FoundationOne®CDx-tTMB检测结果只与ORR（P=0.0469，AUROC=0.30）显著相关，与PFS（P=0.6）和OS（P=0.1）无关。当评估FoundationOne®CDx-tTMB的临床应用价值时，在FoundationOne®CDx-tTMB≥10 mut/Mb 亚组中，帕博利珠单抗治疗可以带来生存获益（表2）。排除已知MSI-H的肿瘤后，在FoundationOne®CDx-tTMB≥10mut/Mb亚组（n=21）中，帕博利珠单抗vs紫杉醇两个治疗组OS的HR值是0.38（0.13-1.13），在CDx-tTMB＜10mut/Mb的亚组（n=170）中是0.98 （0.71-1.35）。
讨论
本项来自KEYNOTE-061的探索性分析首次直接证明了在进展期胃癌/胃食管结合部癌中二线应用帕博利珠单抗时WES-tTMB和临床疗效的相关性，但是在二线紫杉醇治疗时并无相关性。这些发现证明了WES-tTMB对于帕博利珠单抗的临床疗效具有预测价值，但是对于紫杉醇并没有预测价值。在校正PD-L1 CPS后，预先设定的假设检验证实WES-tTMB与临床结局之间存在显著相关性，这提示在胃癌/胃食管结合部癌的二线帕博利珠单抗治疗时，WES-tTMB是一个显著的独立预测指标。在紫杉醇治疗组中并未看到WES-tTMB和OS的相关性。
MSI-H的肿瘤一般具有很高的WES-tTMB，其中大部分均高于预先设定的阈值175mut/exome。但是WES-tTMB和临床疗效的关系并不完全由MSI-H的状态所决定。尽管ROC曲线和HR值的趋势有所下降，但是从K-M生存曲线和ROC曲线的分析中也能够看到在非MSI-H的人群中WES-tTMB和临床预后的相关性。排除MSI-H的肿瘤人群会导致WES-tTMB和CPS评分系统在临床上的实用性的下降。
尽管WES-tTMB≥175mut/exome和CPS≥10的发生率相似（均为约18%），但在帕博利珠单抗组中，WES-tTMB≥175mut/exome亚组似乎比CPS≥10亚组具有更高的ORR。值得注意的是，在高tTMB和非高tTMB的亚组人群中，OS的HR低于PFS的HR，这与全人群的结果相似。尽管样本量有限，这些数据说明帕博利珠单抗在非高tTMB的人群中的疗效低于高tTMB的人群。
最近的一项系统综述和meta分析汇总了超过20000例的胃癌患者，其中EBV的阳性率为8.77%（95%CI：7.73-9.92）：其中I期或II期的EBV阳性率为7.39%，III期、IV期的EBV阳性率为8.8%。本研究中EBV的阳性率为4.7%（28/592），帕博利珠单抗组ORR为13%（2/15），紫杉醇组ORR为15%（2/13）。鉴于样本量过小，并不能下结论说两组之间的ORR没有差异。从KEYNOTE-059的标志物分析中看到5例EBV阳性的患者接受帕博利珠单抗后并没有疗效。其他两篇PD-1抑制剂的临床研究报道，特瑞普利单抗研究入组了4例EBV阳性患者（4/55），纳武利尤单抗研究入组了4例EBV阳性患者（4/80），两个研究中均只有1例达到PR。其他的报道中可以看到PD-1抑制剂的有效率在25%-100%之间，但都是一些最多接受了2线治疗的小样本（n=4-6）研究。
完整的WES平台是研究肿瘤基因学（包括体细胞变异）时进行检测的金标准，也是正在进行的TMB标准化评估中使用的基本方法。但是在临床实践中，NGS的测序技术例如Foundation OneCDx应用起来更方便。将基于WES得到的发现转化为基于Foundation OneCDx的发现尤为重要。与WES-tTMB研究分析结果类似，FoundationOne®CDx-tTMB与帕博利珠单抗组的临床疗效具有相关性，但与紫杉醇疗效无关。本研究使用WES-tTMB和FoundationOne®CDx-tTMB在胃癌人群中得到的结果与之前非小细胞肺癌中帕博利珠单抗单药的数据一致，均提示tTMB与帕博利珠单抗的临床获益相关。
和整体的研究人群相比，本研究受到到了样本量较小的局限。并非所有入组KEYNOTE-061人群都有tTMB的结果，而且进行FoundationOne®CDx-tTMB的分析时样本量更小。
此外，在研究方案设计和审批时，紫杉醇是标准的二线治疗，因此选择紫杉醇作为KEYNOTE-061中的对照组。在研究实施过程中，紫杉醇联合抗VEGF的雷莫芦单抗在一些国家中被批准为二线治疗的一个新选择，但是在本项分析中仍然是对比紫杉醇单药治疗。
在这项KEYNOTE-061的探索性分析中，tTMB终点对于两个治疗组而言是未知的；其结果表明，在进展期胃癌/胃食管交接部癌中二线使用帕博利珠单抗治疗时，tTMB和临床疗效具有相关性。在校正了其他变量（如ECOG）和PD-L1 CPS表达后，tTMB和临床疗效仍然具有相关性，这说明tTMB是一个除了PD-L1之外的显著且独立的预测因子。由于样本量较小，无法进行生物标记物的联合使用的探索性评估，仍需要后续进一步分析。特别指出的是，将非MSI-H人群用PD-L1 CPS状态进一步细分后，发现tTMB ≥175 mut/exome可以带来获益，这一结论也是受限于样本量较小的缺陷，从而需要更大样本的进一步分析。目前帕博利珠单抗已获FDA批准用于经标准治疗失败的不可切除或远处转移的TMB-H（≥10mut/Mb）的实体肿瘤（包括胃癌）。我们将继续探索TMB在其他治疗方案和治疗线数中的价值。
参考文献（略）
王正航 博士北京大学医学部医学博士
北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科主治医师
北京癌症防治学会结直肠癌防治专委会秘书
中国临床肿瘤学会（CSCO）翻译小组成员
蔡洁媛
北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科 硕士研究生
董凤晓
北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科 博士研究生
苏公网安备 32059002004080号
