许婷 翻译；王晰程 审校
北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科
本文刊选自2021年第1期《肿瘤学年鉴中文版-胃肠道肿瘤专刊》，经授权在聚焦oncology 上发表。欢迎转发，未经授权，严禁转载。
原文出处: Yu W, Hurley J, Roberts D, et al. Exosome-based liquid biopsies in cancer: opportunities and challenges. Ann Oncol. 2021;32(4):466-477.
本文将特邀肿瘤学年鉴中文版编委、中国医学科学院肿瘤医院深圳医院高静教授进行解读与点评，敬请继续关注。
摘要
液体活检在恶性肿瘤临床研究中势头正盛，在多个应用领域快速发展。研究者们在将液体活检用于肿瘤的早期诊断与治疗分层以及残余病灶和复发检测方面做出了大量努力。虽然目前大多数的研究关注的是循环肿瘤细胞及循环肿瘤DNA，但外泌体和其他细胞外囊泡也在逐渐形成一个具有潜在更广泛和互补价值的研究平台。外泌体/细胞外囊泡是包括肿瘤细胞在内的细胞释放到周围体液中的小囊泡。外泌体中包含了肿瘤细胞来源的多种物质，如DNA、RNA、蛋白、脂质、糖类结构以及代谢产物等。此外，外泌体表面携带的分子能够用于溯源，从而能够对囊泡进行分类并富集组织特异性起源的特征。外泌体是细胞间交流系统的一部分，肿瘤细胞经常通过外泌体作为生物媒介促进肿瘤的生长。由于外泌体是疾病进程的一部分，因此他们也引起了生物标志物研究的极大兴趣。外泌体在诸如血液、尿液等的体液中相当稳定，可以分离出来用于临床评估，甚至在疾病早期也可以检测到。基于外泌体的生物标志物在临床领域的快速应用，第一个基于外泌体RNA的前列腺癌检测方法已经帮助了超过50000例患者，并被NCCN指南推荐用于早期前列腺癌的诊断。本文将讨论在ctDNA及循环肿瘤细胞研究背景下，外泌体液体活检技术在肿瘤生物标志物及临床应用中的优势及挑战。
关键词：液体活检、外泌体、细胞外囊泡、循环肿瘤细胞（CTC）、游离DNA、循环肿瘤DNA
引言
手术组织活检是实体瘤诊断的金标准。在过去，肿瘤的诊断是基于形态学方法，但现在越来越多的肿瘤开展了分子层面的系统研究以辅助治疗决策测及结局预测。然而，组织学活检并非任何时候都能实现，并且临床医生在基于患者的肿瘤基因特征进行治疗决策时始终要面对肿瘤异质性的问题，同一肿瘤的不同部分的基因组学和表观遗传学特征相互关联但也存在差异[1,2]。此外，在微环境刺激以及治疗压力的克隆选择下，肿瘤的分子特征会随着时间动态演变[3,4]，致使基于既往组织学活检在指导未来治疗决策中会存在局限性[5,6]。此外，活检操作受限于可及性、可重复性、以及患者年龄、时间等多种因素限制并且有可能造成有活检穿刺临床并发症。例如，报道显示肺活检的平均费用是14587$，但并未包含19.3%的患者因手术并发症所产生的人群37745$的额外费用[7]。
组织活检的不足以及分子检测思维的转变逐渐形成了向体液分子检测也就是液体活检的转变。液体活检是重要的进步，具有无创、费用低、实时动态反映肿瘤状态并且在一些情况下能够克服肿瘤异质性（如多发转移病灶）的特点。另外值得注意的一点是，肿瘤组织分子检测由于操作和费用的原因难以实现理想的检测频率，而液体活检更加简便易行、可行性高，虽然敏感性低于金标准的组织学检测，但总体而言能够为更多的患者带来获益[8]。
总的来说，恶性肿瘤液体活检根据体液中肿瘤成分的来源可分为3大类：（i）循环肿瘤DNA（ctDNA），（ii）循环肿瘤细胞（CTCs）以及（iii）肿瘤来源外泌体及其他细胞外囊泡（EVs）（图1）。本文将对这些主题进行综述重点强调外泌体和外泌体多种成分的检测协同作用。对于细胞外囊泡有一系列不同的术语。但在这里为了简单起见，我们将用外泌体和EVs代表所有小于800nm的细胞外囊泡。
图1. 循环系统中的ctDNA、外泌体、CTC。来自肿瘤的分子成分在肿瘤发展的不同阶段通过非常不同的机制被释放到体液中，并代表不同的生物学实体。ctDNA通过凋亡和/或坏死从濒死的肿瘤细胞中释放出来，外泌体在肿瘤形成的各个阶段都被活跃地从细胞中释放出来，而CTCs则是在从晚期肿瘤中释放出来的完整的癌细胞。外泌体参与促进肿瘤的生长、血管形成，甚至扩散和转移过程。图中的元素并非按比例绘制。
ctDNA方法自美国食品与药品管理局（FDA）在上市前批准肿瘤液体活检检测[cobas® 表皮生长因子受体（EGFR）突变检测v2，2016]用于非小细胞肺癌（NSCLC）EGFR靶向治疗的伴随诊断以来，这一新兴领域在临床上获得了巨大发展[9]（表1）。大约10%~30%的NSCLC患者ctDNA中可检测出EGFR突变。ctDNA既能够检测单个基因同时也能进行多基因分子检测，包括二代测序（NGS）等。最近，Guardant360® CDx（ Guardant Health, Redwood City, CA, 2020）是FDA批准的首个用于携带EGFR突变NSCLC二代酪氨酸激酶抑制剂奥西替尼的治疗决策的液体活检技术[10]。在同一领域，FoundationOne ®Liquid CDx（Foundation Medicine, Cambridge, MA, 2020）[11]随后同样获得了FDA批准，用于指导NSCLC、前列腺癌、卵巢癌及乳腺癌的靶向治疗（表1）。这些NGS的检测组合包含了大量基因。虽然并非所有的基因突变在临床上均可治疗，但可用于临床研究筛选或为未来的临床治疗提供有价值的信息。
虽然取得了一定的进展，ctDNA的一个局限性在于其需要足够的ctDNA进行分析检测。这在肿瘤早期充满挑战性。一些研究发现在早期肿瘤中单独检测ctDNA需要不切实际的大量血浆的投入才能够检测出足够数量的ctDNA来源突变[12]。此外，由于潜在的克隆造血（CHIP）的干扰，用大基因panel检测低频突变会增加假阳性的风险[13]，且大量休眠期的肿瘤难以检测到[14]。应用ctDNA进行早期肿瘤筛查近期发展势头正盛并提供了一些可治疗突变的信息[15]。ctDNA甲基化分析结合其他分析物，如蛋白等，用于多种肿瘤甚至是颅内肿瘤的筛查也吸引了较多关注[16,17,18,19]。此外，ctDNA液体活检在检测肿瘤继发耐药以及克服胃肠肿瘤异质性领域具有超过组织检测的优势[20]。多瘤种筛查领域的挑战更大，利用大量参数输入进行机器学习将需要大量的研究以验证其性能和临床价值。在这个过程中，当拓展到应用于一般人群时，在初始训练和验证集中也存在过隐藏未知变量的风险。即使是进行大规模的筛查研究，在分别看肿瘤类型、年龄、种族、民族和其他已知风险因素时，也存在每个类别的患者数量不足的风险[12]。
表1 FDA近年许可和批准的实体肿瘤液体活检项目
肿瘤细胞从原发灶脱离进入通过脉管进入循环系统并播散到转移部位。CTC是肿瘤微小侵袭灶的来源，也是液体活检领域长期的关注点之一[21-24]。由于CTC能够形成微小转移灶驱动疾病进展，因此CTCs的特性十分引人注目[25]。但CTCs是一组具有异质性的细胞，仅有一小部分CTC具有定植和转移能力[26]。
由于CTC是细胞水平的分析物，它们能够传递包含肿瘤细胞RNA、DNA及蛋白水平的信息以及空间信息（如细胞核和胞浆），这些信息是ctDNA和外泌体无法提供的。CTC的研究对肿瘤转移的过程提供了重要信息。例如，CD44依赖性的CTCs聚集赋予了肿瘤细胞干细胞样特性，细胞簇的形成增加了转移能力[27]。CTCs的挑战之一是一些肿瘤释放到循环系统中的CTC十分有限[28,29]，因此CTC研究更适用于晚期肿瘤[25]。然而，一些基于特异性细胞表面标志物的检测方法已经在早期被开发出来以发挥其临床潜能。CellSearch®系统（Veridex, Huntington Valley, PA, 2004）是第一个也是至今唯一一个FDA批准的用于血液CTC定量以及CTC检测技术标准的CTC检测装置[30]。已有研究证实了CTCs计数在早期和转移性乳腺癌[24,31,32]、去势抵抗转移性前列腺癌[33]以及结直肠癌[23]中的预后价值。CTC的分子特征对于靶向治疗的选择具有重要意义。例如，一种雄激素受体的类似物Arv7能够介导雄激素治疗的耐药，CTCs中ARv7 mRNA和蛋白的检出与转移性前列腺癌治疗耐药相关[34,35]。尽管进展很有前景，但CTC研究仍受到了两个重要因素的限制：稀有性和异质性[36]。不同研究对CTC的定义并不相同，因为CTC平台分离出的细胞并非均为肿瘤来源并且携带肿瘤相关的基因变异[30,37]。
基于外泌体液体活检的机遇
在本文中，我们将对外泌体液体活检最先进的研究进展进行系统综述，并主要关注随着表面标志物富集肿瘤来源外泌体技术的发展，这一新兴技术在肿瘤诊断、患者分层、监测以及指导治疗决策领域的机遇（图2）。我们也将回顾结合两种及以上的液体活检分析数据的协同作用以提高临床应用效能，尤其是在肿瘤来源成分有限的早期肿瘤筛查领域。
图2. 外泌体能够进行肿瘤特异性富集。肿瘤过表达的蛋白并不一定是肿瘤特异性蛋白。同一标志物在非肿瘤组织及健康患者中也可能大量产生。通过组织特异性或肿瘤特异性标志物进行外泌体富集能够实现更高的敏感性和/或特异性[38]。已知的肿瘤新抗原（如EGFRv3）也能够同于分离肿瘤特异性外泌体[39,40]。
外泌体及其他细胞外囊泡在一些情况下能够作为其他液体活检形式的替代或补充以达到更好的诊断性能。存活细胞能够持续释放外泌体[41]，因其中包含DNA、RNA及蛋白成分能够提供临床相关诊断信息。死亡细胞通过凋亡和坏死释放小片段游离DNA（cfDNA）进入血液循环，其中来源于肿瘤细胞的部分即循环肿瘤DNA（ctDNA）。ctDNA及外泌体来源的不同表明外泌体提示的是存活肿瘤细胞的信息，在早期检测领域更具前景。例如，外泌体RNA突变能够对cfDNA信息进行补充增加突变检测的敏感性。越来越多的证据表明，多分析方法联合是有优势的[18,42]。数个研究证明cfDNA联合外泌体RNA优于单独的cfDNA检测[43-45]。此外，外泌体内容物能够与外泌体RNA、cfDNA以及疾病特异性蛋白多种因素结合（图3），也能够涉及更复杂的分析。外泌体的独特组成使得其特别适合于多种分析物检测，因为它们携带肿瘤DNA、RNA、蛋白质、脂类、寡糖和代谢产物的多种信息。
图3. 利用外泌体进行多组分液体活检以提高检测性能。cfDNA和外泌体检测的联合有明显的协同作用，能够提高液体活检的效能。外泌体包含的RNA和DNA (exoDNA)能增加突变的拷贝数[43]，并能进行RNA的剪接变异[46-49]、融合[50,51]以及转录组分析[52.53]。结合ctDNA突变与cfDNA甲基化和/或外泌体分析，可以更全面地勾画肿瘤来源的生物标志物蓝图，并提供更好的诊断性能。来自不同来源的外泌体(以颜色区分)也可被富集以增加生物标志物的组织特异性。
cfDNA, 循环游离DNA; ctDNA, 循环肿瘤DNA.
外泌体的尺寸在纳米级别，多数直径在30~200 nm之间。外泌体是大量细胞外囊泡的一部分，通过磷脂膜的融合再通过多泡体的胞吐作用进入体液，或者通过小的胞质突起从细胞表面出芽形成[54,55]。肿瘤细胞活跃释放囊泡被认为与肿瘤细胞内丝裂原活化蛋白激酶通路活化相关[48,56-58]。有研究报道肿瘤细胞在48 h内可以释放超过20000个囊泡[59]。值得注意的是，其中包含了一些大囊泡，肿瘤微泡，直径可达10mm，同样也携带来自供体细胞的RNA、DNA以及蛋白[60-62]。所有这些囊泡都承载着生物物质，如各种来自肿瘤的生物标志物，包括那些涉及致瘤过程的标志物。外泌体被发现是促进细胞恶性行为，如刺激肿瘤细胞生长、抑制免疫应答、诱导血管生成、促进肿瘤细胞迁移以及转移灶形成的关键驱动因素[63]，因此是非常有前景的肿瘤标志物。在过去的40年里，外泌体领域的研究经历了一个爆炸式的发展（图4A）。此外，临床试验数据库ClinicalTrials.gov反映出肿瘤外泌体用于临床诊断及转化研究的迅猛发展（共72个研究，图4B），明显超越了心血管领域（7个研究）、神经退行性疾病（5个研究）以及糖尿病领域（4个研究）的研究。由于并非所有临床研究均纳入此数据库中，这些数据可能低估了真实情况。
图4.（A）外泌体研究发表数量。外泌体在诊断、治疗以及作为细胞间通讯组成部分方面近年来吸引了越来越多的关注。（B）通过关键词(外泌体、细胞外囊泡、EVs和微囊泡)进行手动搜索，消除重复命中和治疗应用，在ClinicalTrials.gov上共检索出71个登记的外泌体相关临床研究（截至2020.10.22），包含诊断、多种肿瘤生物标志物等。
在包括国立卫生研究院共同基金资助的细胞外RNA通讯联盟等多方资助下，液体活检细胞外RNA的分析和鉴定领域取得了重要进展。细胞外RNA通过与Argonaute II（Ago2）[64]、高密度脂蛋白/低密度脂蛋白形成核糖核蛋白复合物或被外泌体或其他细胞外囊泡包裹从而在细胞外环境中幸免于被降解[41,66]。
最早于2006年有研究报道了细胞培养液中外泌体RNA的存在[67]，随后Skog等发现从患者血浆中分离出的外泌体中可以检测出肿瘤来源突变 [41]，这就为在诊断中使用外泌体提供了机会。外泌体介导RNA的细胞间传递，这被认为是细胞间通信的一种新媒介[66]。相关研究发现细胞外囊泡含有丰富的小RNA分子（<200个核苷酸），其中绝大多数RNA＜700个核苷酸，导致对循环RNA的早期研究主要集中在由核糖核蛋白复合物或细胞外囊泡保护的microRNAs（miRNAs）上[66,68-72]、piwi-interacting RNA以及各种非编码RNA片段，如核糖体RNA[76,78]、转运RNA、穹窿RNA和Y RNA[79-83]。然而，后续基于NGS的EV RNA研究表明所有的RNA亚型均存在与细胞外囊泡中，包括信使RNA（mRNA）[41,67,73,74]、mRNA片段、长非编码RNA（lncRNA）[76,77]。全转录组方法，如RNA测序（RNA-seq），现在正被用于探索脑脊液（CSF）、血浆[84-86]和尿液样本[78]的EV内容物检测。
虽然目前临床生物标志物的研究似乎主要是miRNA研究主导，但通过验证并用于临床的生物标志物更经典的是mRNA。研究对miRNA感兴趣的重要原因是其丰富性和已知的调控潜能。然而，从液体活检的角度看，较长的RNA尤其是已知靶标已知突变和可靶向突变的mRNA是更容易研究的选择。除了测量基因表达水平和检测肿瘤特异性体细胞突变，长RNA提供了额外的信息来研究其他可能表明疾病状态/进展的过程。例如，特异性检测RNA选择性剪接亚型（如Arv7，MET14外显子跳跃突变）、融合基因（如EML4-ALK和ACR-ABL）、RNA编辑[87]和环状RNA[88]代表了能够弥补DNA、小RNA或蛋白质分析研究空缺新方法。既往应用RNA-seq对长RNA进行测序的研究报道的长RNA转录本的比例相对较小，转录覆盖率较低，因此得出了外泌体仅能够携带mRNA和lncRNA小片段的的结论，直到近期外泌体长RNA-seq研究的进展才纠正了这一结论（对长RNA进行测序而非长片段测序）[48,52,53]。
外泌体提高液体活检突变检测敏感性
循环核苷酸，包括外泌体包被的RNA相比与ctDNA增加了可检测的突变总拷贝数[43]。一项直接对比ctDNA及ctDNA联合外泌体RNA的双盲研究发现外泌体RNA联合ctDNA能够检测出10倍以上的突变拷贝数（ctDNA和ctDNA联合外泌体NRA分别检出中位24 copies/ml对比234 copies/ml的EGFR激活突变）[43]。这大大提高了在血液样本中检测到突变的几率，尤其是在ctDNA循环拷贝数非常低的疾病早期阶段十分有意义。另一项研究应用外泌体RNA联合ctDNA检测EGFR突变达到了92%的敏感性，即使是局限于胸内的肺癌（M0/M1a）敏感性也保持在88%，而ctDNA在这一群体的检测是十分困难的[44]。此外，近期的一项纵向研究探索了一段时间内外泌体和ctDNA中BRAF、KRAS和EGFR突变水平，结果表明，与单独使用ctDNA相比，联合分析显著改善了生物标志物与治疗结果的相关性[45]，进一步强调了结合活细胞来源外泌体和濒死细胞来源cfDNA联合可以提高液体活检检测成功的可能性。
和其他液体活检方法一样，在进行RNA检测时，将肿瘤信号从正常细胞信号的“噪音”中分离出来是具有挑战性的。尤其是在当从血浆中直接分离RNA时血小板来源RNA会带来大量巨核细胞RNA背景干扰[89]。但是外泌体独特的特点是它能通过表面标志物进行富集，并且可以通过肿瘤特异性和肿瘤富集的表面蛋白标志物进行外泌体亚类的区分。事实上，多个概念证明研究已经证明了这种方法的可行性[90-92]，包括从多种恶性肿瘤患者血浆中通过上皮细胞表面黏附分子（EpCAM）富集肿瘤来源外泌体[68,69]。富集外泌体亚群在技术上具有一定挑战性，需要良好优化的程序，由于膜蛋白的取向或折叠或者外泌体表面表位的有效性，能够与组织或纯化蛋白结合的抗体不一定能够与外泌体很好地结合[93]。此外，外泌体的表面特性使它们能够粘附许多表面，包括其他外泌体。与用于免疫捕获的管状或珠状表面的非特异性结合可能导致重要生物学特性的丢失和特异性的降低。另一种用于外泌体和其他EV的疾病/组织特异性分析的新兴技术是纳米流式细胞术。尽管目前更适合于低通量检测，但该技术可以基于表面标志物对单个EVs进行分类/表征，在提高基于外泌体的液体活检的性能方面具有巨大潜力[94-96]。
外泌体内和表面的蛋白同样也能作为肿瘤标志物。几种不同的蛋白质检测或外泌体捕获方法可以使用包括血浆、血清、尿液、唾液、脑脊液和腹水在内的各种生物液体来区分癌症类型。为了利用血浆中的外泌体检测脑癌，已经成功地在脑肿瘤中探索了EGFRvIII等生物标记物[39,97]。HER2作为乳腺癌标志物的特异性检测也已被广泛报道，包括表面等离子体共振[98]、表面增强Raman光谱[99]和电动力微剪切等几种不同的方法[100]。Yoshioka等人发现诸如CD147、CA19-9及CEA等表面标志物能够通过一种基于珠状信号富集荧光检测系统ExoScreen从结直肠癌患者血清中检出。另一种荧光微芯片方法能够应用胰岛素样生长因子受体1和EPCAM特异性受体检出肺癌患者血浆外泌体或应用EPCAM和CA125特异性检出卵巢癌外泌体[102]。通过对CA125、CA19-9、CD24、CLDN3、EpCAM、HER2和MUC18的几种不同的富集/检测方法，也实现了对包含卵巢癌在内的生物标志物的外泌体的特异性富集[103]。最后，血浆外泌体中的前列腺特异性抗原PSA能够有效鉴别前列腺癌和前列腺良性增生[104]。蛋白检测技术在近期进展到了单个分子水平[105,106]，肿瘤细胞外囊泡的蛋白组学分析，如前列腺癌，目前正在进行中[107]。以上进展以及对肿瘤生物学行为的了解使得这种无创性蛋白标志物检测能够实现其充分的临床价值。
外泌体液体活检的进展与挑战
第一个商业化检测试剂盒ExoDx_ Prostate（IntelliScore）（EPI）在2016年被批准用于诊断前列腺癌[108,109]。这种非侵入性尿液检测利用了三种外泌体RNA转录产物（ERG、PCA3和SPDEF）的表达特征，用于PSA水平在2-10 ng/ml“灰色地带”的50岁以上男性的前列腺癌风险管理。测试给出0到100的分数，分数越高，患高等级疾病的风险越高（格里森评分7分或更高）。该测试以15.6分作为界值排除高级别前列腺癌（91%阴性预测值），该检测能够避免27%的患者进行可能带来有害并发症的活检。在这个界值的测试性能已经在两个前瞻性多中心试验中得到验证。近期一项前瞻性双盲对照研究发现真实世界中医生应用EPI检测能够比应用目前最佳诊疗标准的对照组多诊断出30%的高级别前列腺癌。这进一步强调了外泌体来源的RNA生物标记物在早期癌症检测中的应用价值。至今，这一基于外泌体的检测已经用于超过50000例患者的诊疗，并被纳入国家综合癌症网络指南（NCCN）指南批准用于前列腺癌的早期检测[110]。
外泌体同样能够携带DNA，外泌体相关循环DNA同样能够代表多种肿瘤DNA[62,111-113]。具有潜在临床用途的外泌体衍生DNA肿瘤生物标志物正在增多，包括基因组重排[114]、突变[113]和拷贝数变化[115]。
除核苷酸和蛋白质，脂质和聚糖也正逐渐成为潜在的生物标记物，在前列腺癌中已经有了脂质标志物的研究[116-118]。外泌体分析的新技术也正在开发中，使得外泌体为基础的分析方法可以方便地用于临床诊疗中。微流体设备和其他小型便携工具现在被用于外泌体的分子检测[119,120]，而透射表面等离子体共振等技术已经显示出了分析卵巢癌外泌体生物标志物的前景[103]。
虽然液体活检在肿瘤领域做出了很多研究，这也是本篇综述的重点，基于液体活检的循环标志物检测在器官移植[121,122]、心血管疾病[123]、神经退行性疾病[124,125]、胎儿或产前诊断[126]、免疫性疾病[127,128]领域也开展了研究。液体活检在神经退行性疾病中的应用与肿瘤学在颅内肿瘤方面有着紧密的联系，在这一领域样本收集是最主要的困难。研究发现细胞外囊泡能够透过紧密的血脑屏障[129]，因此可以被用于检测神经退行性疾病，这相比于脑脊液检测创伤更小，尤其是对于颅内高压的病人。
使用液体活检平台进行的临床研究，与其他临床研究类似，通常昂贵且耗时。cfDNA和外泌体的优点之一是在冻存标本中十分稳定可以回顾性检测。外泌体核苷酸分析采集时不需要保护剂，血浆可以在25℃状态下保存2天或者经过多次冻融循环处理而不引起DNA或RNA显著降解[130]。研究证据表明，在-80℃下保存25年以上的血浆样本能够成功进行外泌体RNA转录组分析（未发表数据）。作为诊断分析物，RNA、DNA，或外泌体中的蛋白质在样品运输和储存过程中保持信息的稳定对于应用回顾性样本开发生物标志物十分重要。加之最近的研究发现，基于外泌体RNA与cfDNA结合的临床研究实际上使检测在敏感性和特异性方面比单独的外泌体RNA或cfDNA更具有临床有效性，基于外泌体的液体活检方法具有一些重要的临床优势。并非所有的癌症特征都反映在DNA突变上。目前还没有cfDNA突变检测能够区分高级别的前列腺癌（Gleason 7分或更高）与良性和低级别前列腺癌。然而，来自尿液外泌体的三个基因RNA特征在这一方面显示出了良好的表现[108,109]。另一种被提出的检测血浆中血小板来源RNA的液体活检技术其有效性和临床应用仍有待观察[131]。
尽管肿瘤生物标记物的研究非常多，只有少数能够通过验证实现商业化。从测试开发人员的角度来看，进行适当的控制以及研究人群必须合理设计以确保生物标志物可以推广到预期使用人群都是十分必要的。这并非微不足道，因为许多因素，包括年龄、种族、环境因素和既往疾病，以及所有与样本收集相关的分析前的变量都会影响生物标志物的效能。
总结
肿瘤液体活检领域已经取得了诸多进展，临床上可及的检测也越来越多。但阻碍检测广泛普及的障碍也值得关注，液体活检的前景是不可否认的，他们在克服传统活检局限性方面存在许多优势。其中突变检测的挑战之一就是克隆性造血问题，此外，液体活检可能发现大量惰性肿瘤，而这些肿瘤并没有必要诊断[14]。
无创性和对肿瘤分子状态的实时评估使这种诊断更容易进行，也可以随着时间的推移进行动态检测，更好地监测潜在的疾病进展并进行治疗干预。基于这些前景，外泌体提供了一种独特的生物标志物内容，可以单独使用，也可以与其他类型的液体活检联合使用。用于分析肿瘤源性外泌体技术的不断发展将会带来前沿的、稳定的新一代内容丰富的肿瘤诊断工具。
参考文献（略）
专家介绍
王晰程，北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科副教授，副主任医师。
CSCO青年专家委员会 常委
中国抗癌协会大肠癌专委会 内科学组/遗传学组委员
北京癌症防治学会 结直肠癌专委会 常委
《Annals of Oncology》中文版 编委
专家介绍
许婷，北京大学医学部八年制博士研究生在读，北京大学肿瘤医院消化内科住院医师。
苏公网安备32059002004080号
