审校：贾友超
血液和淋巴系统恶性肿瘤是首批被NGS测序的癌症类型之一，可能是因为它们更容易获得。基于这些研究，具有诊断、预后和/或预测影响的临床相关基因畸变的数量迅速增加，这增加了对分子诊断的需求，以确保在诊断环境和合理的时间范围内，检测到不同类型的基因改变。
对于恶性血液病，遗传学自几十年来一直是诊断的重要组成部分，包括细胞遗传学、荧光原位杂交(FISH)和靶向突变分析和/或Sanger测序等方法。靶向基因面板已经被添加到诊断实验室的方法库中。无论诊断测试的类型是什么，必须根据国际标准和准则统一方法。为了确保可比较的结果，特别是在多中心研究中，结果的解释和临床报告必须遵循既定的指南。这一点尤其重要，因为不同的NGS检测涵盖了一系列不同的遗传变异，基因检测结果变得更加复杂。
本文综述了目前应用于淋巴细胞恶性肿瘤临床诊断的各种分子技术及其优缺点，还对需要考虑的方面进行了探讨，以协调临床解释和报告的NGS数据。
河北大学附属医院肿瘤内科副主任
博士，主任医师，硕士生导师
专注恶性淋巴瘤诊治及基础研究
阜阳市肿瘤医院肿瘤内科
淋巴系统恶性肿瘤的诊断技术
分子细胞遗传学
长期以来，细胞遗传学或染色体显带分析一直用于定义不同淋巴细胞恶性肿瘤中观察到的复发性染色体畸变。虽然细胞遗传学在白血病(即急性髓系白血病[AML]，急性淋巴母细胞白血病[ALL]和慢性髓系白血病)中仍然处于中心地位，但分子细胞遗传学或FISH是成熟淋巴类恶性肿瘤的首选。FISH技术的引入不仅可以对中期染色体进行分析，也可以对间期染色体(即未分裂的细胞)进行分析。因此，FISH比细胞遗传学更快，可用于筛查复发诊断或风险分层基因组畸变。此外，FISH可以应用于各种组织类型，如血液涂片、印迹以及福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。FISH探针可用于大多数经常性的畸变，通常用于检测淋巴瘤的易位；例如，套细胞淋巴瘤中的t(11;14)和弥漫大B细胞淋巴瘤中的MYC和BCL2易位。在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中，一组探针通常用于检测风险分层异常，即11q缺失、13q缺失、17p缺失和12三体，而在多发性骨髓瘤中，探针用于识别t(4;14)、t(11;14)、t(14;16)、1q增益和17p缺失。然而，虽然间期细胞上的FISH可以快速回答是否存在特定的遗传畸变，但这并不是一种特别敏感的技术；检测畸变的cut off 值必须由每个实验室确定，通常在5%左右。
有针对性的突变分析
在NGS时代之前，大多数临床实验室采用Sanger测序进行靶向突变分析。上世纪80年代以来，Sanger测序一直是金标准，但如果研究多个基因或大量基因，就显得昂贵和费时。另一个缺点是它的灵敏度通常在10%-20%。
在CLL中，TP53突变与化疗免疫治疗的差应答率和总生存率低有关，而TP53基因筛查现在是任何方案开始前的必须性筛查。TP53基因分析(包括外显子2-11)通常是通过Sanger测序来完成的，尽管最近许多实验室开始使用NGS。
另一种基于测序的分子检测是IGHV基因突变状态，这决定了未突变IGHV基因的CLL预后较差，而突变IGHV基因的CLL预后较好。该分析主要是通过聚合酶链反应(PCR)扩增克隆IGH重排，然后进行Sanger测序，尽管新的NGS方案已经开发。
对于TP53和IGHV基因分析，欧洲CLL研究倡议(ERIC)提供了技术建议和指导。它还实施了专门的认证系统，使临床实验室能够根据标准操作程序定期认证他们的方法(Sanger测序或NGS)。
对于热点突变的检测已经建立了特异的检测方法，如毛细胞白血病的BRAF(V600E)和Waldenström巨球蛋白血症的MYD88突变(L265P)。这些使用等位基因特异性PCR或定量PCR检测突变等位基因。最近，数字微滴PCR技术已经被开发出来，能够进行非常敏感的检测(降低到0.01%)，可以用于检测复发突变或跟踪患者一段时间。例如，它用于检测接受伊布替尼治疗的CLL患者的BTK/PLCG2突变。
NGS
利用该技术，我们可以分析整个基因组(全基因组测序[WGS])、外显子组(全外显子组测序)或特定的区域，即靶向的NGS或基因面板。根据测序的具体情况，获得的序列读取数是不同的。使用WGS，对肿瘤样本的推荐序列深度为90(对匹配的正常样本为30)。对于目标基因面板，根据面板的大小，目标是至少500个高序列深度，但最好超过1000个。
基于扩增子的技术的局限性是潜在的扩增偏差，特别是在测序困难的区域(即GC丰富和/或重复区域)，可能导致扩增子的丢失，以及增加低频率、假阳性突变的风险；当FFPE材料用作输入来源时，这种情况会发生。
为了研究基于扩增子的基因板的稳健性，我们在ERIC内部最近进行了一项多中心研究，使用三种不同的技术(Multiplicom, HaloPlex和TruSeq)，针对CLL中的11个反复突变的基因。所有6个中心分析相同的48个CLL样本，每个技术由两个中心分析。变异等位基因频率(VAF)在5%以上的基因突变技术和中心之间取得了非常高的一致性，而VAF <5%的变异则出现差异。因此，我们得出结论，基于扩增子的测序可以安全地用于VAF >5%的体细胞突变检测。
我们还测试了一种包含独特分子标识符(UMI)的高灵敏度分析方法，该方法可以证实VAF <5%的亚克隆突变这种方法去掉了重复读取，提高了灵敏度。因此，在设计新面板时，应该考虑包含UMI。
这些面板通常更大(数百个基因)，产生更多的序列读取。这意味着可以对更多有问题的区域进行排序。另一个优点是，它们能够同时检测不同类型的基因组畸变(因为它们的尺寸更大)。例如，除了调查单个核苷酸变异(SNV)和插入/缺失(indel)的选定数量的基因外，也可以分析拷贝数变化(即缺失和扩增)和结构变异(如易位)。He等人将基于DNA和RNA的广泛、捕获的基因组合用于大量血液系统恶性肿瘤(n=3696)的诊断，包括不同的淋巴系统恶性肿瘤。使用骨髓或FFPE样本，他们可以检测所有上述类型的基因组畸变，具有较高的准确性和可重复性。
基因面板已迅速被引入骨髓恶性肿瘤的常规诊断。在瑞典，我们最近从基于54个基因扩增子的基因面板转移到基于国家捕获的包括195个基因的髓系面板。在淋巴样恶性肿瘤中，目前临床正在使用小扩增子基因面板。如前所述，在CLL中，在治疗开始前检测TP53突变，许多中心已经转向基于扩增子的NGS基因面板。在淋巴瘤中还有其他的诊断、预后和预测影响的基因可以用这些更小的面板捕获。例如，检测某些突变具有诊断价值，例如:Waldenström’s巨球蛋白血症中的MYD88突变、毛细胞白血病中的BRAF突变、脾边缘区淋巴瘤中的KLF2突变、T细胞淋巴瘤中的STAT3/STAT5B突变，而其他基因突变与治疗反应相关(如Waldenström的巨球蛋白血症患者ibrutinib治疗的MYD88/ CXCR4突变)或治疗耐药性相关(如ibrutinib治疗的CLL患者BTK/PLCG2突变)。
考虑到淋巴系统恶性肿瘤的本身和演变中涉及到广泛的遗传异常，基于捕获的面板的引入将对这一类患者特别有用，不仅可以捕获SNV/indels，但也有拷贝数畸变(CNA)和易位以及更复杂的标记，如IG/T细胞受体基因分析。瑞典最近开发了一种基于捕获的淋巴组织面板，其中包括252个目前正在验证的基因，并将很快被用于常规诊断。
报告和结果判读
对于所有类型的分子报告，重要的是要包括一些关键参数，以便其他实验室可以很容易地理解结果。报告应包括一般信息，如个人身份、转诊医生，以及更具体的信息，如调查的组织类型、应用的方法和评估的遗传畸变(表1), 对于FISH分析，重要的是说明使用的探针、研究的细胞数量以及应用的cut off值。对于更有针对性的分析，例如热点突变检测，还应该提供技术和灵敏度。
对于基于NGS的分析，阐明基因覆盖率和序测序深度以及变异呼叫的截断点是很重要的。根据HGVS命名法，应列出序列变异，并包括cDNA/蛋白水平的变异描述。还应该注意的是，如果使用特定于位点的数据库或国际指南(例如，遵循美国医学遗传学学会(ACMG)标准)，该变异是否被认为是致病的。此外，在报告的结论性意见中，应当说明，根据世卫组织分类、临床共识指南或现有出版的文献，以前是否在该疾病实体中发现过具有诊断、预后或预测影响的体细胞突变。包括CNA和/或结构畸变的更复杂的数据将需要继续开发生物信息学工具来可视化报告的数据，如拷贝数图或环状图的格式。
一些学术中心和商业公司已经开发出新的临床决策支持系统，帮助确定突变是否被认为是“可操作的”， 基于大型数据库，对于某个变体，这些工具可以在发现临床相关结果时发出警报，并提供到可用的潜在靶向药物和/或临床试验(例如FDA批准的药物、正在进行的临床试验，或一种药物是否已用于另一种恶性肿瘤)的链接，这些支持系统主要用于实体癌，很少用于血液系统恶性肿瘤。
表1 基于测序的分子报告中包含的数据
结论
近年来，血液系统恶性肿瘤的基因诊断已从细胞遗传学发展到靶向NGS策略(图1)。对于淋巴系统恶性肿瘤，我们应用不同的FISH分析以及靶向测序/NGS进行诊断和风险分层。然而，随着在淋巴系统恶性肿瘤中检测到的临床相关基因变异数量的不断增加，我们需要继续开发基于NGS的“动态”策略，如基于捕获的测序，包括大量的基因和遗传畸变类型。
图1 遗传学发展
FISH ，荧光原位杂交
在罕见疾病诊断中，WGS已经越来越多地取代了多基因检测。对于我们通常进行多基因检测的血液恶性肿瘤来说，这是否也是一种前进的方向？一些国家和/或地区的项目现在正在测试WGS结合RNA测序是否可以取代急性白血病(ALL和AML)的“旧”技术。Klintman等人的研究结果表明，WGS与靶NGS在CLL中SNV/indels的一致性较高，而FISH与WGS的一致性较低。因此，在我们开始使用全基因组技术之前，我们必须确定所有强制性的基因组畸变都能被检测到，并在合理的时间框架内提供。
另一个快速发展的领域是液体活组织检查和循环肿瘤DNA的检测，它们有望实现对淋巴瘤患者基于NGS的敏感随访，并可以在难以进行活组织检查的情况下检测基因异常。这些分析尚未进入淋巴系统恶性肿瘤的临床应用，但预计它们将成为未来诊断的重要组成部分
最后，尽管世界范围内有一些正在进行的针对淋巴系恶性肿瘤的精确医学研究，但启动基于靶向药物/免疫疗法的未来临床试验以实现精确医学的全部潜力将是非常重要的。
Rosenquist R. Molecular diagnostics and reporting in lymphoid malignancies: Current status and beyond. Hematological Oncology. 2021;39(S1):73–77. https://doi.org/10.1002/hon.2849.
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