对于患有卵巢癌（OC）的女性，检测林奇综合征（LS）的最佳筛查手段现还未有定论。在这项研究中，作者对从加拿大安大略省的三个癌症中心招募患有非浆液性和/或非粘液性卵巢癌的女性进行LS种系测试并完成了相应的家族史评估，并采用错配修复（MMR）免疫组织化学（IHC）和微卫星不稳定性（MSI）检测进行肿瘤筛查评估，并对以上筛查手段的敏感性，特异性以及阳性、阴性预测值与种系结果的黄金标准进行对比, 从而比较各种筛查方式的性能特征。这一研究于2020年8月18日发表在美国癌症协会（ACS）的同行评审期刊《Cancer》上。
研究背景
林奇综合征（LS）是由错配修复（MMR）基因（主要为MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM）的种系突变引起的常染色体显性遗传易感性综合征，LS会增加病人患结直肠癌（CRC; 40%-80%），子宫内膜癌（EC; 33%-61%）和卵巢癌（OC; 9%-12%）的终身风险。对于患有LS的女性，妇科肿瘤作为恶性肿瘤的前哨作用时长可达10年，因此这为其他癌症的癌前筛查和早期癌症治疗提供了可能性，同时，通过对其一级亲属的级联检测也可帮助预防癌症。
从历史上看，LS是通过分析是否符合阿姆斯特丹II临床标准的家族史来鉴定的，但由于敏感性低，现在多个机构建议在通用肿瘤诊断时采用免疫组织化学（IHC）对MMR蛋白表达进行检测，并在诊断EC和/或CRC时进行微卫星不稳定性（MSI）检测。由于MMR基因的缺陷，与LS相关的肿瘤会特征性地表现出MSI或在IHC中显示MMR蛋白表达缺失（MMR deficient [MMRd]）。但由于大多数MMRd EC和/或CRC患者为散发性，且因表观遗传MLH1启动子甲基化而导致MLH1 / PMS2缺陷，因此通常将无MLH1启动子甲基化的MMRd肿瘤患者转诊并进一步进行关于LS的遗传咨询和种系测试。为了进一步确定这些个体患LS的几率，在加拿大安大略省对70岁以下EC和CRC患者样本进行IHC和MLH1启动子甲基化分析。与MSI测试相比，IHC价格更便宜，可直接进行基因测试，在保证性能的同时更易于操作。
虽然常规筛查已成为为EC和CRC患者确定LS的日常检查项目，但目前的举措似乎完全忽略了OC患者。OC是女性中第三大最常见的LS相关性癌症，MLH1携带者的特异性风险为5％至20％，MSH2携带者的为10％至38％，MSH6携带者的为1％至11％，PMS2携带者的风险尚不确定。与LS相关的OC通常是非浆液性和非粘液性通常是非浆液性和非粘液性的，回顾性研究估计，非浆液性OC中2％至29％存在MMRd，但尚不清楚这些患者中有多少LS携带者。此外，尽管有一些研究认为需要进行组织特异性筛查以鉴定OC患者中LS情况，但据作者所知，尚无各种筛查方法的比较研究，因此，本研究的主要目的是比较各种可鉴定非浆液性和/或非粘液性OC的预期人群中LS情况的筛查方式的性能特征，次要目的是确定该特定人群中LS的发生率。
材料与方法
研究对象
研究对象于2015年9月至2019年6月期间，从3个安大略省妇科肿瘤学中心招募，并获得相关机构的批准和知情同意书。 资格标准包括组织学上的各种组织学级别和国际妇产科联合会（FIGO）阶段的确认的非浆液性和/或非粘液性侵入性上皮OC。 要求所有参与者完成家族史问卷（FHQ），对其卵巢肿瘤进行IHC和MSI检测，并为MMR基因下一代测序（NGS）基因样板提供血样进行种系突变测试，患者临床信息可从电子病历中提取。
肿瘤检测：IHC和MSI
IHC用来检测所有4 µm石蜡切片上MLH1，MSH2，MSH6和PMS2的蛋白表达，如果与相邻的正常组织相比，肿瘤细胞核中不存在染色，则认为该肿瘤为MMRd。 对于MSI测试，DNA将分别从肿瘤和正常组织中提取并使用聚合酶链反应进行扩增，如果5个标记中等于或多于2个显示不稳定，则被认为高度微卫星不稳定（MSI-H），否则为微卫星稳定（MSS）。 除非等于或多于2个标记物证明具有稳定性，否则少于3个可以扩增的位点，该结果被认为缺少有效性。出于对敏感性和特异性计算的目的，对于IHC，在MMR蛋白表达中存在局灶性或异质性损害的肿瘤被视为MMRd，且在IHC和MSI检测中存在任何难以判定的情况将被认为是MMR完整和/或MSS。
种系靶向面板测序
所有人员将会使用铺满混合型捕获探针的NGS面板进行种系测试。DNA将从福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤切片通过宏观解剖提取的血沉棕黄层或邻近的正常组织中获得，提取后，DNA将被剪切，并基于每个样品制备富含靶标的基因组文库。样品随后在Illumina NextSeq 500设备上进行测序，所得读数与人类参考基因组（UCSC Genome Browser hg38）对应。该生物信息学方式可探知MMR基因种系单核苷酸的变异、插入、缺失、拷贝数异常和结构重排。面板将会对所有MLH1缺陷患者进行MLH1启动子甲基化分析。为了评估性能特性，将具有致病性或可能存在致病性变异的患者视为患有LS，而那些具有未知闲着性（VUS）变异的患者则认为其种系结果为阴性。
筛查检测方式
以下几种筛查方式的性能表现（敏感性，特异性，阳性预测值[PPV]和阴性预测值[NPV]）和作为黄金标准的种系测试结果进行比较：1）仅IHC（任何存在IHC缺陷的情况被认为是测试阳性）；2）对MLH1缺陷型患者进行IHC MLH1启动子甲基化分析；3）仅MSI（任何MSI-H的情况将被认为测试阳性）；4）家族病史（任何符合OMOH标准的病例均被视为测试阳性；5）IHC与MSI（先对IHC完整患者进行IHC的测序检测，后进行MSI检测；任何存在IHC缺陷或MSI-H的情况被认为是测试阳性）；6）IHC MLH1启动子甲基化分析和MSI（先用IHC [对所有MLH1缺陷患者进行MLH1启动子甲基化分析]进行测序检测，后对未甲基化和/或IHC完整的病例进行MSI测试）。后用SAS软件进行数据分析，统计显著性设置为P=0.05。
结果
基线信息统计
图1 对符合研究标准的研究对象招募数量、筛查方式、种系病变等情况的总结
表1 研究对象的临床病理特征
MMR蛋白质缺陷患者
在15例存在MLH1 / PMS2缺陷的肿瘤患者中，有2例具有MLH1致病性种系变异（13.3％）（表2）。在MLH1阴性或VUS种系结果的13例患者中，有12例肿瘤体细胞MLH1启动子甲基化过高，1例患者的双等位基因体细胞MLH1拷贝数缺失。共有7名MSH6缺乏症患者（100％），5名MSH2 / MSH6缺乏症患者中有1名（20％）具有致病性种系变异（表2）。在MSH2种系检测为阴性的4例患者中，有1例在肿瘤中存在双等位基因单核苷酸变异，而其他3例患者拒绝进行肿瘤测序，一名PMS2缺陷患者确认存在致病种系变异。
表2 错配修复蛋白IHC结果与种系状态
筛查检测方式间的比较
表3列出了各种筛选方式的性能特征比较，与其他方式相比，IHC MLH1启动子甲基化分析和MSI的筛查方式敏感性 (92.3% ; 95% CI, 64.0%-99.8% [P=不显著]) 和特异性(97.7%; 95% CI, 94.2%-99.4% [P<0.05]) 最高，PPV为75.0%（95%CI，47.6%-92.7%）, NPV为99.4%（95%CI，96.8%-99.9%），缺少1例存在种系PMS2致病变异的LS患者。IHC MLH1启动子甲基化分析的方式也表现良好，敏感性为84.6%（95%CI，54.6%-98.1%），特异性为97.7%（95%CI，94.3%-99.4%），缺少2例LS患者，其中一例MLH1 c.306G> T病原体变异伴随IHC完整肿瘤。只进行家族史分析的筛查方式敏感性最低，为54.5%（95%CI，23.4%-83.3%）。
表3 对研究对象采用不同筛查策略与家族分析诊断错配种系致病变异（林奇综合征）的性能表现
LS患者的临床病理特征
有13名LS携带者比非LS携带者年轻许多（50岁 vs 53岁；P= 0.042）。 无LS的MMRd肿瘤研究对象亚组的中位年龄为54岁（范围43-62岁）。 对于同时患有OC和EC的患者（30名女性），LS发生率为17％。 患有LS的研究对象更有可能发展至更严重的疾病阶段（62％ vs 31％；P=0.042）。 在排除同时患有OC和EC的研究对象之后，LS患者仍然表现出向更严重疾病阶段发展的趋势（III期：40％ vs 16％； P = 0.196）。 11名女性（84.6％）已患有妇科恶性肿瘤作为前哨癌。 四名LS研究对象（30.8％）不符合Amsterdam II的临床标准，SGO 20％至25％的标准或OMOH遗传评估家族史标准，只能通过IHC或MSI测试确定LS。
讨论
基于目前的研究发现，在患有非浆液性和/或非粘液性OC的研究对象预期队列中，LS的发生率为7％。尽管相关的研究数量较少，并且对于它们的回顾性和主要的病理学检查较为受限，但本研究的LS发生率远高于先前文献提供的发生率（3%-4%）。在当前研究中，MMRd和MSI-H的发生率分别为13％和11.7％，考虑到MMRd和MSI-H与病理的关联，LS的验前概率为41％，这一数据也高于EC和CRC患者。IHC的前瞻性研究表明，约有25％的EC患者为MMRd，其中20%的患者LS检测呈阳性。相似的，15%-20%的CRC患者存在MMRd，其中10%-15%的患者患有LS。鉴于本次研究中，非浆液性和/或非粘液性OC患者的LS验前概率较高，因此建议MMR缺陷的肿瘤补充试验应被作为一项常规检查，同时作者建议使用IHC MLH1启动子甲基化分析方法进行筛查，因为这种方法具有高敏感性和特异性，并且在临床上最容易实施。
针对EC和CRC已经考察了多种筛查LS的方法，没有任何筛查方式被证明是完美的。例如，目前对EC患者进行IHC和MLH1启动子甲基化分析的算法筛查会需要一系列额外的复杂测试来确定LS，这对于患者和临床医生而言非常耗时。全面的NGS方法可能更简单高效，并且正在成为其他癌症类型的治疗标准，如针对BRCA1 / 2突变的高级别浆液性OC。同样，对于CRC患者中，最近的一项研究表明，使用NGS面板进行前期肿瘤测序可以替代当前的LS29测序。根据这项研究，美国国家综合癌症网络指南现在将前瞻性肿瘤测序列作为对CRC患者可行的检测策略。同样，对于EC和非浆液性和/或非粘液性OC患者来说，前期肿瘤测序，这种可简化当前的肿瘤检测级联并提供肿瘤特异性信息的方法，应当进一步研究，这可能为化疗后MMRd复发的癌症患者开辟新的疗法。
同时各种筛查方式的成本应被考虑。最近一项针对EC患者，比较了MSI，IHC，MLH1甲基化分析和NGS微观成本研究发现，用IHC进行肿瘤初诊是价格最低的方法。在CRC文献中，IHC的价格被认为比MSI便宜约3倍，另外，IHC还易于操作，灵敏度高，并且能够直接对相关MMR基因进行种系检测。在当前研究中，IHC（并采用额外的MLH1启动子甲基化分析）配合MSI的筛查方法被发现具有最佳灵敏度，但比只采用IHC（并采用额外的MLH1启动子甲基化分析）仅多检测出一例。从长远来看，使用IHC进行肿瘤分类很可能是最具成本效益的方法，并且更易于实施。在降低肿瘤NGS面板测序的成本之前，使用IHC进行肿瘤分类诊断将成为大多数医疗机构的护理标准。
尽管人数不多，但本研究中13例确诊为LS的患者的年龄与先前文献中的年龄相似（平均年龄为47.6岁vs 45.3岁）。先前研究检查了747名患有与LS相关的OC女性的临床特征，确定最常见突变是MSH2（47％），最常见的组织学特征为子宫内膜样的和/或透明的细胞亚型。 与该研究不同的是，本研究中，MSH6为最常见的种系突变，所有MSH6缺陷型患者均被发现有致病变异。 在先前的研究中，大多数与LS相关的OC患者都处于早期阶段（I / II期> 80％），生存期较乐观，但本研究中的患者均处于更后期的癌症阶段且预后不佳。
当前研究的局限性之一是在福尔马林固定、石蜡包埋的载玻片上缺少正常的相邻组织，因此相关MSI信息不完整。另一个限制是种系信息不完整，26名存在种系信息缺失的患者均被认为MSS和/或MMR完整，因此当前研究对象中LS发生率可能略高于真实发生率。此外，鉴于研究机构是癌症专门机构，可能存在固有的转诊偏见。然而，安大略省所有妇科癌症护理都是区域性的，当前的研究也仍可反映出了现实情况。此外，出于本研究的分析目的，IHC检测有局灶性MMRd的患者（4例）被认为是MMRd，有1例MMR可疑结果被认为是MMR完整。有证据表明，存在局灶性MMR缺陷和/或MMR蛋白表达异质性丧失的患者具有独特的分子畸变，应进一步测试这些患者的种系突变。
本研究的结果表明， IHC（并采用额外的MLH1启动子甲基化分析）加MSI是鉴定非浆液性和/或非粘液性OC女性患者LS最具灵敏性和特异性的筛查方式。 考虑到现实中的实施成本，IHC（并采用额外的MLH1启动子甲基化分析）可能是最合适的筛查策略。 对于新诊断为非浆液性和/或非粘液性OC的所有患者，和MMRd和/或非甲基化的所有患者都应进行额外的LS确认检测，并应考虑将额外的肿瘤检测纳入标准护理手段。
Kim S, Tone A, Kim R et al. Performance characteristics of screening strategies to identify Lynch syndrome in women with ovarian cancer. Cancer. 2020. doi:10.1002/cncr.33144
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