“ALK学院”借助线上资源，搭建学术交流平台，旨在汇聚肺癌ALK靶向学术内容，提高医生对ALK靶向治疗规范性的认识，精进诊疗水平。本期“ALK学院”精选6篇中国专家文献，每日一文以飨读者！
ALK融合基因作为继NSCLC EGFR突变后又一被发现的新型驱动基因，携带ALK融合基因的个体会获益于ALK TKI治疗，而不同患者对ALK TKI治疗的反应和持续时间差异很大。本研究是吴一龙团队开展的大样本中国肺癌人群分析，旨在探讨中国肺癌患者ALK重排与临床特征之间的关系以及阐述ALK融合基因的序列复杂性，相关研究结果于2017年发表在Lung Cancer杂志。
肿瘤学教授，博士生导师，IASLC杰出科学奖获得者
广东省人民医院（GGH）终身主任
广东省肺癌研究所（GLCI）名誉所长
广东省肺癌转化医学重点实验室主任
吴阶平基金会肿瘤医学部会长
中国临床肿瘤学会(CSCO)前任理事长
中国医师协会精准医学专委会副主任委员
广东省临床试验协会（GACT）会长
中国胸部肿瘤协作组（CTONG）主席
国际肺癌研究会(IASLC)理事会(BOD)核心成员，国际分期委员会前委员
欧洲肿瘤学会（ESMO）中国区总代表
背景：
在间变性大细胞淋巴瘤中，间变性淋巴瘤激酶 (anaplastic lymphoma kinase, ALK) 基因重排首次被证实可以与核仁磷酸蛋白 (nucleophosmin, NPM1) 发生融合。ALK融合基因被定义为继非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 突变后又一被发现的新型驱动基因，通常携带ALK融合基因的个体会受益于ALK酪氨酸激酶抑制剂 (tyrosine kinase inhibitors, TKI) 治疗。然而，不同患者对ALK TKI治疗所产生的反应和持续时间差异很大。因此，亟需研究能够阐述导致上述反应异质性的潜在机制。
目前而言，ALK基因的融合伴侣差异很大，包括棘皮动物微管相关蛋白样4 (echinoderm microtubule-associated protein-like 4, EML4)，驱动蛋白家族成员5B (kinesin family member 5B, KIF5B) 以及驱动蛋白轻链1 (kinesin light chain, KLC1) 等。EML4基因是ALK融合阳性肺癌患者的主要5'伴侣，并且EML4基因内的染色体断裂点经常发生在不同位点。然而，ALK基因内的断点相对来说更为保守，主要发生在19内含子或20外显子。相比于EGFR L858R患者，EGFR 19缺失患者可以从EGFR TKIs治疗获取更长的无进展生存期。此外，EGFR 19缺失患者在接受一线afatinib治疗后，可以获得更长的总生存期获益。这一现象激发我们去探究中国肺癌患者ALK变体类型的复杂性。
方法：
本研究为一项前瞻性研究，在2011年1月至2013年2月期间，共有1474例肺癌患者(95.5％为汉族，0.5％为少数民族) 入组。其中，1387例为NSCLC，54例为小细胞肺癌 (small cell lung cancer, SCLC)，33例为原发部位为宫颈、乳腺和甲状腺的恶性肿瘤伴有肺转移。所有标本均获自广东省肺癌研究所 (Guangdong Lung Cancer Institute, GLCI) 生物样本库，并获得伦理委员会批准。NSCLC患者的主要组织学亚型如表1表示。
表1
本研究的实验流程如图1所示，通过标准逆转录聚合酶反应 (reverse transcription polymerase chain Reaction, RT-PCR) 和cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA ends, RACE)-偶联PCR并测序，对所有样品进行ALK重排测定。分析ALK融合和所有变异类型的发生频率，并在NSCLC中对其临床特征进行评估。此外，研究还对15例ALK阳性变异类型进行了分子克隆，用于序列复杂性分析。
结果：
在本研究中，共有1474例肺癌患者参与了ALK融合基因检测。在1387例NSCLC样本中，共有71例患者携带ALK融合基因，ALK重排的总体发生率为5.1％ (71/1387)。而在其余54例SCLC或33例宫颈、乳腺和甲状腺癌伴有肺转移的患者中未发现ALK基因融合。
NSCLC患者的临床病理学特征如表1所示，所有NSCLC患者的中位年龄为59岁 (范围23-89岁)。相比于未发生ALK重排的患者，ALK重排更倾向于发生在确诊时年龄较小的患者 (中位年龄48岁vs 60岁; P< 0.001)。与男性患者相比，女性肺癌患者发生ALK融合基因的风险更高 (7.2％ vs 3.9％; P= 0.007)。从不吸烟者比吸烟者更容易罹患ALK重排 (6.9％ vs 3.0％; P= 0.001)。71例携带ALK融合基因的NSCLC病例中有68例为腺癌，2例为鳞状细胞癌，1例为类癌。腺癌和肺腺癌患者携带ALK重排的几率分别为6.2％和1.0％ (P<0.001)。确诊时处于晚期的NSCLC患者 (IIIB-IV期) 与I-IIIA期患者相比，ALK重排的发生率显著更高 (6.4％vs 3.2％; P= 0.009)。没有EGFR突变的患者比携带EGFR突变的患者更容易发生ALK重排 (7.2％vs 1.2％; P<0.001)。就诊断方式而言，经皮穿刺活检方法和手术活检在ALK重排阳性率方面并无明显差异 (P= 0.287)。在71例ALK重排病例中，共有6例 (8.5％) 患者共同存在EGFR和ALK变异。
在具有ALK易位的NSCLC患者中，Variant 1, 2和3型的分布分别为39.4％ (28/71)，32.4％(23/71) 和15.5％ (11/71)。 每种ALK融合的亚型如表2所示，EML4基因是最主要的ALK融合伴侣基因，发生率为94.4％ (67/71)。而非EML4伴侣的发生率为5.6％ (4/71)：3例为KIF5B-ALK融合，剩余1例为DCTN-ALK融合。此外，根据两种PCR检测方法，2例患者携带2种ALK融合亚型：1例并发Variant 1和9融合，结果如图2A所示；另外1例患者同时具有Variant 3和2融合，结果如图2B所示。
表2
图2
将所有15种ALK阳性PCR产物成功克隆到载体中用于序列复杂性分析，详细结果可见于表3。在15个非选择性EML4-ALK阳性产物的病例中，存在Variant 1和3的2个病例 (13.3％) 表现出三种融合亚型的共存。在Variant 1的一种情况下，ALK的20外显子可以与EML4的13外显子(E13; A20) 融合，检测到两种新的在Variant 1亚型。一个亚型是ALK的20外显子与EML4的13外显子融合 (E13del63; A20)，结果如图3A所示。另一个亚型是EML4的12外显子的一部分首先与EML4的7外显子的一部分连接在一起，然后，EML4的13外显子与ALK的20外显子融合 (E7E12E13; A20)，结果如图3B所示。在Variant 3的一个病例中 (报告的Variant 3a [E6; A20]和3b [E6ins33; A20]除外)，第三个新亚型是EML4的6外显子和3外显子首先连接在一起，然后，EML4的6外显子与ALK的20外显子融合 (E3E6; A20)，结果如图3C所示。所有新型亚型的百分比不超过一个样品中所有变体的10％。
此外，在6例Variant 3型患者中，Variant 3a和3b总是同时存在的，并且Variant 3a的百分比与Variant 3b的百分比高度一致。而在3例Variant 2型患者中，并未发现有新的亚型。
表3
图3
点评：
尽管携带ALK融合基因的个体可以从ALK TKI治疗中获益，目前仍然存在不同患者对ALK TKI治疗的反应以及持续时间差异显著的治疗现状。不同亚型的ALK融合患者对于不同的ALK TKI治疗的临床反应是否存在差异也亟需进一步研究证实。本研究通过对大样本的肺癌患者分析发现，ALK重排更容易发生在年轻、女性、不吸烟、腺癌、疾病晚期和未发生EGFR突变的患者。新的ALK变异类型的识别、EGFR突变和ALK融合的共存、ALK变异类型以及亚型的共存都揭示了ALK融合的多样性和序列复杂性。期待在未来的研究中，可以根据ALK融合亚型进行细分以指导ALK阳性患者的临床诊疗，真正给患者带来生存获益。
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Clinical characteristics and sequence complexity of anaplastic lymphoma kinase gene fusions in Chinese lung cancer patients.
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