作者：胡夕春教授
来源：肿瘤资讯
CDK4/6抑制剂临床前转化型研究
专家简介：胡夕春教授
Q：为何选择luminal型乳腺癌？
点评：
回顾最初的研发历程，来自UCLA的Richard Finn和Dennis Slamon在各类型乳腺癌细胞株中探索敏感的细胞系。最初设想可能会对TNBC有效，而最终却发现对luminal型乳腺癌细胞株敏感（包括ER+/Her2+），所以进一步在临床前和临床研究中针对luminal型乳腺癌开展后续研发并获得成功。目前FDA已批准上市的palbociclib的适应症主要针对于HR+/HER2-晚期乳腺癌，后续还有同类抑制剂开展的多项研究正在进行中。
CDK4/6抑制剂单药作用
Palbociclib（PD 0332991）为辉瑞公司研发，在前期的体内外实验中，已被证实对各种肿瘤如骨髓瘤、卵巢癌、结直肠肿瘤、脑胶质瘤和乳腺癌等展现出很好的抑制肿瘤细胞生长作用。2009年在乳腺癌中，Finn等通过对47株人乳腺癌细胞的筛查，发现CDK4/6抑制剂PD 0332991对luminal型（ER+）的细胞株抑制作用最明显（ 包括ER+，Her-2扩增的细胞系），而对基底细胞样型（basal-like）最不敏感。而在卵巢癌细胞系的筛选中，发现对于Rb阳性p16低表达的细胞系，PD 0332991最为敏感，能介导时间依赖性的G1期细胞阻滞。进一步的基因分析提示PD 0332991对Rb表达阳性伴有p16低表达或cyclin D1过表达的肿瘤细胞最为敏感，提示p16，cyclin D1和Rb的状态可能作为对PD 0332991敏感性的预测指标。
同时研究也表明，PD 0332991耐药的机制之一即为Rb的表达缺失。在体内动物实验中，单药PD 0332991能抑制Rb阳性老鼠荷瘤的生长，而对Rb缺失的老鼠则无效。在他莫昔芬耐药乳腺癌模型中，PD 0332991有效对RB去磷酸化，抑制细胞周期。在他莫昔芬耐药的细胞株中，PD 0332991单药治疗有活性，细胞对他莫昔芬重新敏感，药物联合使用时活性增加。在激素治疗难治性乳腺癌模型中，PD 0332991能有效停止增殖，诱导细胞衰老，导致稳定的细胞周期停滞，不同于ER拮抗剂的作用。
Ribociclib（LEE011）为诺华公司研制，作为单药，Ribociclib能在体外通过减少Rb1的Ser780和Ser807/811位点磷酸化，介导G1期的细胞阻滞，从而抑制神经母细胞瘤和脂肪瘤细胞的生长并且在动物模型中同样展现出抑制肿瘤生长的作用。
Abemaciclib（LY2835219）为礼来公司研发的CDK4/6特异性抑制剂，与PD 0332991不同的是，研究发现Abemaciclib尚能抑制CDK9激酶的活性，具体的生物学功能尚不清楚。此外，研究报道发现Abemaciclib能在体外抑制维罗非尼耐药的黑色素瘤的生长
CDK4/6抑制剂与内分泌治疗联合
雌激素主要通过激活CDKs以及相应的cyclins而推动细胞周期的进行。体外的一项细胞株实验发现，在激素受体阳性的MCF-7乳腺癌细胞中，用雌激素拮抗剂处理MCF-7细胞，引起CDK4激酶活性降低，发生G1期细胞阻滞。但随后加入雌二醇又能激活CDK4和cyclin D1，Rb高度磷酸化，使细胞再次进入S期。上述现象表明CDK信号通路的失活可能参与到内分泌治疗的生物学过程中，同时也提示CDK抑制剂与内分泌联合使用的可能。在体内，用p18缺失的激素受体阳性型（HR+）乳腺癌细胞系构建裸鼠荷瘤，发现成瘤率下降，而p18作为一种内源性CDK4/6抑制剂，表明通过抑制CDK4/6激酶活性可以抑制HR+型乳腺癌细胞的成瘤能力。此外，另外一项实验发现，cyclin E过表达的乳腺癌细胞对抗雌激素治疗耐药且对CDK4抑制剂不太敏感。而通过抑制CDK2的活性，降低cyclin E的表达能恢复细胞对抗雌激素和CDK4抑制剂的敏感性。上述实验结果提示CDK4/6抑制剂和抗雌激素治疗的共同耐药机制可能为cyclin E过表达。
基于cyclin D1-CDK4/6信号通路在HR+细胞抗雌激素治疗中的作用以及上述的前期体内外模型结果，提示着CDK4/6抑制剂联合抗雌激素治疗的可能性。进一步在体外细胞模型中，Finn等证实PD 0332991与他莫西芬具有协同作用，在不同临床相关药物浓度水平，平均联合指数<1。并且PD-0332991能使耐药细胞对他莫昔芬再次敏感，在获得对芳香酶抑制和ER拮抗剂耐药的模型中抑制生长。后续研究发现与氟维司群同样存在协同作用。
CDK4/6抑制剂与化疗药物联合
CDK4/6抑制剂与化疗药物的联合存在着一定的争议，还在进一步的探索中。前期的体外实验发现，经紫杉醇处理后的人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞发生凋亡，可能的机制之一为上调了内源性的CDK抑制因子p21，提示紫杉类药物可能通过CDK信号通路引起细胞凋亡。但是随后的体外实验中，CDK4/6抑制剂与细胞毒性化疗药联合的结果存在着一定拮抗与争议。在一组Rb表达阳性的三阴性乳腺癌细胞系中，PD 0332991分别与多柔比星和紫杉醇联用。研究结果发现，两药联合介导了细胞周期的阻滞而非细胞毒性作用，提示PD 0332991诱导的细胞周期阻滞可能影响了化疗药物的细胞毒性作用，可能的机制为PD 0332991增加了细胞DNA损伤修复的机制。因此，不建议将以DNA损伤为主要机制的化疗药物与CDK4/6抑制剂联用。但研究也发现，CDK4/6抑制剂与化疗药物以一种序贯的给药方式会产生协同作用。如在Rb阳性的骨髓瘤细胞系中，CDK4/6抑制剂序贯硼替唑咪产生协同细胞毒性作用。可能的机制为CDK4/6抑制剂先行介导G1期阻滞，使细胞停留在早期G1期，当CDK抑制剂撤药后，细胞快速进入S期，而对硼替唑咪介导的凋亡作用敏感，产生协同作用。类似的序贯给药现象在卵巢癌细胞中也得到研究。在卵巢癌OVCAR5和HEY细胞系中，当先给入紫杉醇再序贯PD 0332991，两者之间产生协同作用（CI值小于1），而当先给入PD 0332991再给入紫杉醇后，两者之间产生拮抗作用（CI值大于1）。综上所述，CDK抑制剂与化疗药物联用时需慎重，因为不同种类的化疗药以及给药的序贯方式都会影响两者之间是否具有协同作用。
CDK4/6抑制剂与分子靶向药物联合
鉴于CDK抑制剂对Her-2扩增的乳腺癌细胞的中度敏感性，以及上述CDK抑制剂与内分泌联合的协同作用，提示着CDK抑制剂与曲妥珠单抗联合治疗的可能性。后续体外实验也表明CDK抑制剂与曲妥珠单抗具有协同作用并能逆转其耐药。
PI3K/Akt信号通路是一条重要的促生长信号通路，参与到多种肿瘤的生物学过程中包括增强、转移、凋亡及药物耐药过程中。最近许多研究表明，PI3K信号通路的异常激活与药物耐药相关，如在复旦大学附属肿瘤医院的II临床试验入组了67例Her-2阳性的转移性乳腺癌患者，用PTEN的低表达或无表达或PIK3CA突变来提示PI3K通路激活。研究发现接受曲妥珠单抗治疗时，PI3K通路激活组和未激活组的中位PFS分别为4.5个月和9.0个月（P = 0.013）。接受拉帕替尼加卡培他滨治疗时，有效率分别为9.1%和31.4%（P = 0.05），临床获益率分别为36.4%和68.6%（P = 0.017），提示PI3K通路激活也可能导致拉帕替尼耐药。这也就提示着能否通过抑制PI3K/Akt这条信号通路达到抑制肿瘤生长以及逆转药物耐药的作用，而最终达到治疗肿瘤的目的。
在前期细胞学实验中，研究发现CDK抑制剂能增强细胞对PI3K抑制剂的敏感性，两者具有协同作用。可能的机制为CDK抑制剂通过下调cyclin D1表达，使Rb去磷酸化，下调p-AKT的表达，促进Caspase偶联凋亡的启动，从而增强PI3K抑制剂介导的细胞凋亡作用。如在胰腺癌细胞中，CDK4/6特异性抑制剂PD 0332991与MEK和PI3K/mTOR抑制剂联用时具有协同作用。而在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中，PD 0332991与mTOR1抑制剂依维莫司（everolimus）联用具有协同抑制肿瘤细胞生长。另外一项研究中发现，在雌激素受体（ER）阳性细胞的裸鼠荷瘤模型中，CDK4/6抑制剂Ribociclib单用具有抑制肿瘤生长的作用，而当与来曲唑或氟维司群联用时，抑制作用更明显。而当三者联用时，即CDK4/6抑制剂（如PD 0332991、Ribociclib）、PI3K抑制剂（如BKM120、BYL719）与内分泌治疗药物来曲唑或氟维司群三者联合使用时，肿瘤抑制作用最明显。基于上述实验结果，CDK抑制剂与PI3K抑制剂的临床试验也正在开展中。
Ras/Raf/MEK/ERK信号级联通路是一条可被广泛激活的有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路，能将胞外信号转入胞浆内，从而引起一系列蛋白的表达变化，继而影响细胞的功能。该通路主要由一个三级酶联功能单位构成，即Raf、MEK、ERK激酶依次被磷酸化激活。Ras/Raf/MEK/ERK信号通路常在多种肿瘤中过度激活，引起肿瘤的恶性转化。临床上也涌现出靶向该通路的特异性抑制剂，如MEK抑制剂PD 184352，BRAF-V600特异性抑制剂维莫非尼（vemurafenib）等，其中维莫非尼已被FDA批准用于黑色素瘤存在BRAF-V600突变患者的治疗。虽然治疗初期展示出很好疗效，但由于继发性耐药的出现，使患者获益受限。研究表明，维莫非尼耐药的机制可能与cyclin D1过度激活有关，而CDK4/6抑制剂能逆转其耐药。在前期维莫非尼耐药的细胞及动物模型研究发现，MAPK信号通路失活，cyclin D1存在着表达上调并且对CDK4/6抑制剂abemaciclib治疗敏感，这提示着CDK抑制剂与Raf抑制剂在临床上联用的可能，目前一系列临床试验正在开展中。
CDK4/6抑制剂与放疗联合
体外实验发现，敲除CDK4表达能增强细胞对放疗的敏感性，在人乳腺癌MDA-MB-468细胞中发现CDK4抑制剂与放疗具有协同作用，提示着CDK4/6具有增敏放疗的作用。同时，有研究表明cyclin D-CDK4/6-p16INK4A信号通路参与肿瘤干性特征调节过程中，而肿瘤干性往往与放疗抵抗有关。肿瘤干细胞是指一群增殖缓慢，处于相对静息状态，但又具有自我分化功能，能重新诱导肿瘤的产生。在一项三阴性乳腺癌细胞系的体外研究中发现，与Rb表达缺失的乳腺癌干性细胞相比，Rb表达阳性的细胞对放疗更加敏感。同时另外研究也发现，从肝癌和胶质瘤细胞系中分离出的放疗抵抗细胞与亲代细胞相比，AKT表达上调以及cyclin D-CDK4/6信号通路的过度激活，而抑制AKT及cyclin D-CDK4/6信号通路的活性又能恢复对放疗的敏感性。此外，在放疗抵抗的细胞株中敲除CDK4的表达后能恢复对放疗的敏感性，但敲除CDK2的表达对放疗敏感性并无影响。上述体外实验提示抑制CDK4/6激酶的活性能增加放疗的敏感性，可能的机制为促进肿瘤干细胞的分化，使更多的肿瘤细胞暴露于放疗介导的细胞死亡过程中。前期体外实验表明CDK抑制剂具有增敏放疗的作用，在临床实践过程中两者联用是否使患者获益还需进一步的探讨。
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