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皮肤和粘膜黑色素瘤的基因分子学研究进展

2015年05月07日

基于特定基因变异筛选的个体化分子靶向治疗已在黑色素瘤中取得明确的疗效。皮肤和粘膜黑色素瘤不仅临床表现、生物学特性不同，遗传学特点也存在差异。

MAP激酶通路

MAP激酶通路活化与黑色素瘤病理生理过程密切相关。既往观点认为MAP激酶通路活化的分子基础涉及自分泌或旁分泌生长因子受体信号通路；事实上，研究发现多数情况下MAP激酶通路活化是由通路中信号转导分子的活化突变所致。90%以上的黑色素瘤患者存在MAP激酶通路的持续活化，驱动了疾病进展及播散。

NRAS: RAS编码蛋白具有GTPases活性，可使RAS从结合GDP的非活化形式，转变成结合GTP的活化形式。活化的RAS以极高的亲和力结合RAF蛋白，使RAF定位于细胞膜上并活化。RAS家族由KRAS，HRAS和NRAS组成，黑色素瘤中RAS变异以NRAS突变为主。高加索人种皮肤黑色素瘤中NRAS突变率为15%-20%，且90%的突变位于61号密码子，61号密码子变异可使NRAS维持结合GTP的活化形式，持续激活下游信号通路，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进肿瘤的侵袭和转移。中国皮肤黑色素瘤患者NRAS突变率为6%。粘膜黑色素瘤中也有NRAS突变的报道，突变率从13%-22%不等；中国粘膜黑色素瘤患者NRAS突变率为9.2%。

BRAF: RAF家族由三个成员组成：ARAF、BRAF和CRAF(RAF-1)。BRAF仅需结合RAS即可引起活化，而ARAF和CRAF还需要其他信号分子才能活化。所有的RAF共享RAS为上游激活因子，MEK为唯一的下游效应因子。Davies等人发现66%的黑色素瘤中存在BRAF错义突变，是黑色素瘤中最常见的变异基因。BRAF突变常发生于较年轻的个体，并且多见于非慢性阳光损伤性皮肤黑色素瘤患者中。BRAF最常见的突变类型是谷氨酸替代第600位缬氨酸（V600E），导致BRAF持续性活化，使BRAF磷酸化下游底物MEK的能力增加了800倍。BRAFV600E功能获得性突变在高加索人种皮肤黑色素瘤中占43%-50%。中国皮肤黑色素瘤患者BRAF突变率为32%，V600E突变约占90%。

与皮肤黑色素瘤相比，粘膜黑色素瘤中BRAF活化突变的频率较低。美国MD Anderson癌症中心针对1112例黑色素瘤开展了一项回顾性研究，发现BRAF突变仅存在于皮肤黑色素瘤中，粘膜黑色素瘤中BRAF均为野生型。其他研究发现粘膜黑色素瘤BRAF突变率为3%-10%，主要分布在鼻咽、口腔黏膜等头颈部粘膜黑色素瘤中。中国粘膜黑色素瘤患者BRAF突变率为12.5%，与国外报道接近。

KIT: KIT编码145kDa的跨膜蛋白，属于III型受体酪氨酸激酶，在造血干细胞、肥大细胞、黑色素细胞、胃肠间质细胞等细胞中表达，对细胞增殖、生存和分化发挥重要作用，其突变与急性髓细胞白血病、胃肠间质瘤、睾丸精原细胞癌的发生密切相关。与胃肠间质瘤不同的是，黑色素瘤中KIT的缺失和插入突变较少，其变异主要表现为点突变和野生型KIT扩增。高加索人种皮肤黑色素瘤中KIT基因突变率约为20%左右，中国皮肤黑色素瘤患者中KIT变异率为16.5%。粘膜黑色素瘤中报道的KIT突变率从5%-27%不等，中国粘膜黑色素瘤KIT突变率为19.2%。

p16INK4A -CyclinD1/CDK4-pRB信号通路

细胞周期是指一系列分子相互作用调控的细胞分裂过程。细胞周期检查点的一个关键功能是评估DNA损伤，DNA损伤的细胞有转化为永生化细胞（如肿瘤细胞）的潜能，因此理想情况下DNA损伤细胞应进入衰老或凋亡过程。这种损伤控制发生在G1-S检查点，视网膜母细胞瘤蛋白（RB）抑制G1-S期转换，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）如CDK4可以使RB蛋白失活，这个过程发生在细胞进入DNA合成期之前。细胞周期调控分子发生变异会导致细胞增殖失控，这些携带有损伤DNA、具有转化生长特性的、永生化的肿瘤细胞就会蔓延生长。

黑色素瘤中p16INK4A-Cyclin D1/CDK4-pRB信号通路变异发生率高达22%-78%。p16INK4A由CDKN2A基因编码，后者位于染色体9p21，编码两个读码框架重叠的基因，p16INK4A和p14ARF，其蛋白产物结构完全不同，分别通过RB1通路和p53通路负调控细胞周期而发挥抑癌基因的作用。24%-40%的家族性黑色素瘤存在p16INK4A的点突变、缺失，或启动子甲基化引起的活性缺失。散发性黑色素瘤中p16INK4A突变比较罕见，Kumar等人曾报道31例散发性黑色素瘤中p16INK4A的突变率为26%。散发性黑色素瘤中RB途径的失活多是由p16INK4A发生非基因突变引起的表达沉默或CDK4/Cyclin D1活化而引起。

CDK4与Cyclin D1结合后磷酸化RB，使RB失活细胞进入DNA合成期。p16INK4A能够结合并抑制CDK4，中止细胞周期进程。p16INK4A与Cyclin D1的遗传学改变可通过上调CDK4活性，干扰RB1通路，而影响细胞周期进程。CDK4的活化突变和扩增会导致细胞增殖失控，这种突变在家族性黑色素瘤和散发性黑色素瘤中均有报道。CDK4突变位点多发生在第24位密码子（R24C和R24H），是功能获得性突变。Cyclin D1由CCND1基因编码，与CDK4一样，当Cyclin D1过表达时执行癌基因功能。来自于高加索人种的研究显示，与其它亚型相比，CDK4基因扩增和Cyclin D1基因扩增在肢端型皮肤及粘膜黑色素瘤中更常见。

粘膜黑色素瘤中还存在高频率的p16INK4A变异。2007年，Suzuki等人在12例头颈部粘膜黑色素瘤中检测到有6例存在p16INK4A基因的突变或杂合性缺失。近期一项对原发鼻腔粘膜黑色素瘤的研究数据显示55.2%的患者存在p16INK4A缺失。

PTEN-PI3K-AKT通路

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)-AKT通路可被不同配体结合于相应受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTK)或G蛋白偶联受体(Gprotein coupled receptors, GPCRs)而活化。PI3K活化PIP2和PIP3，PIP2和PIP3与细胞内的PH(pleckstrinhomology)结构域相互作用，使含PH结构域的AKT定位于细胞膜内表面，并引起AKT蛋白Thr308和Ser473位点磷酸化而激活。PTEN可使PIP2和PIP3去磷酸化而直接拮抗PI3K的活性。

PTEN作为抑癌基因可抑制细胞侵袭和播散，促进细胞凋亡。10%-30%皮肤黑色素瘤存在PTEN 活性缺失。PTEN缺失引起PI3K-AKT通路的活化，导致细胞周期、细胞接触和细胞迁移的改变。PTEN缺失可引起痣的恶性转化，尤其是在BRAF突变的黑色素细胞中。部分皮肤黑色素瘤中存在PI3K的活化突变或扩增。40%-60%的皮肤黑色素瘤存在AKT3基因拷贝数增加，导致AKT活性增加，与疾病进展相关。NRAS突变除了可激活MAP激酶通路外，也能活化PI3K-AKT通路，而PTEN和NRAS很少同时发生变异。相比之下，约20%的皮肤黑色素瘤同时存在BRAF突变和PTEN缺失。一项对29例原发鼻腔粘膜黑色素瘤的研究发现，所有的样本均表达pAKT，其中72.4%的样本中pAKT阳性细胞比例达到75%以上。有关粘膜黑色素瘤中PTEN-PI3K-AKT通路中其它分子的研究较少。