类器官能够很好地模拟肿瘤的异质性，包括肿瘤微环境、免疫反应等，这有助于更准确地预测患者对药物的反应和治疗效果，且可以在药物进入体内前进行药物筛选，从而节约临床试验的时间和成本。然而，类器官的研究仍面临一些挑战，如技术限制、伦理问题等。就乳腺癌类器官的研究进展，包括类器官的定义、发展历程、优势以及在乳腺癌研究中的应用进行综述。
陈芷彦,伍秋苑,邓裕华等.类器官技术在乳腺癌研究中的现状及应用[J/OL].天津医药,1-5[2024-01-26].
乳腺癌是目前导致妇女癌症死亡的首要恶性肿瘤，且其发病率和病死率仍在不断上升［1］。乳腺癌的耐药、复发和转移仍旧是大多数患者治疗失败的主要原因。根据组织病理学和分子评价，乳腺癌目前被分为多个亚型，包括 Luminal A 型、Luminal B 型、人表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）过表达型和三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC），这些亚型在遗传、病理和临床上都存在差异，针对不同亚型选择的治疗方案决定了乳腺癌患者的预后［2］。
类器官是具有干细胞潜力的细胞在三维（three-dimensional，3D）培养系统下孵育以通过黏附聚集、自组织并分化成具有相应器官组织形态的3D细胞团，旨在通过体外培养和扩增人体细胞，构建出具有 特定功能和结构的器官模型［3］。该方法在过去20年中得到了广泛的关注和发展。2011年，荷兰哈勃克研究所的Sato团队［4］成功地从成人干细胞培养出了肠道类器官，这一突破标志着在培养皿中生长3D微型器官的重大进展。2015年，该团队又成功建立了胃和肝脏类器官［5］。此后类器官相关研究进展迅 速。研究人员开始使用类器官来模拟疾病发展，包括癌症、囊性纤维化和各种遗传性疾病，这为了解疾病机制提供了更好的模型，并为测试潜在的药物治疗方法提供了更准确的模拟环境。近年来，类器官研究已经成为生物医学领域的一个重要研究方向。
类器官的发展及优势
传统的体外肿瘤细胞培养模型有细胞系模型（cell lines，CLs）和人源性肿瘤异种移植模型（patient-derived xenografts，PDXs），但2D培养的细胞难以表达如在体内观察到的组织和细胞的关系，在2D系统中培养的分离组织细胞逐渐失去其形态并变得扁平，异常分裂，同时影响细胞分化表型［6］。再者，细胞信号传送会因培养环境的不同而发生改变，这解释了2D培养细胞实验的药物筛选结果无法在小鼠模型或临床试验中重现的原因［7］。人源性免疫小鼠模型在研究免疫疗法方面具有一定的优势，例如能够模拟患者体内自体肿瘤抗原 T 细胞的情况，同时也存在一些弊端，如实验成本高，且无法完全模拟人类免疫系统的复杂性。此外，人源性肿瘤异种移植模型中来自同一患者的肿瘤细胞和T细胞的信息可能无法完全反映肿瘤的实际情况，而不同患者之间的生物学差异可能会影响治疗效果，因此，在使用该模型进行研究时需要谨慎考虑其局限性［8-9] 。
相比上述传统肿瘤模型的培养需要大量时间和样本，患者源性肿瘤类器官（patient-derived tumor organoids，PDTO）可以从切除肿瘤和活检获得的小量样本中快速培育而成，在精准医学的临床前肿瘤建模中有成功率高和时间成本低的优点，且患者源性肿瘤类器官可以概括个体患者原生肿瘤的细胞和分子特征，故类器官是目前最适合作为精确癌症治疗的肿瘤模型［10］。
乳腺癌类器官的设计
找到合适的乳腺/乳腺癌类器官模型可助研究团队更好地理解乳腺癌的发展和治疗，利用模型可以研究乳腺癌细胞的生长、扩散方式及其遗传特征，同时评估不同药物对乳腺癌细胞的疗效。Sachs等［11］在通用类器官模型培养的方案基础上，向培养液中添加与乳腺发育和肿瘤发生相关的神经调节蛋白1（neuregulin 1，NRG1），并通过添加一种名为 Y-27632的Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil kinase，ROCK）抑制剂来调控培养液中ROCK 的含量，以及调节培养液中表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）、类器官构建最常用的培养因子之一 Wnt-3A（Wnt family member 3A）和 p38 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）抑制剂 SB202190 的浓度，成功建立了具有>100个原发性和转移性乳腺癌类器官系的活体生物库。通过分析建立的类器官模型的组织学及基因组特征，该研究证实实验中培育出的乳腺癌类器官能很好地保留组织学和遗传异质性，有利于进行体外药物筛选，为乳腺癌的治疗提供更准确和个体化的方法，同时为开发新的治疗策略和药物提供基础。Prince等［12］设计出了一种名为 EKGel 的纳米纤维水凝胶来替代基底膜提取物（basement-membrane extract，BME），用于乳腺癌类器官的起始、生长和维持，从而避免了患者来源的肿瘤类器官严重依赖小鼠肿瘤BME的弊端。在EKGel中培养的PDOs表现出与原始肿瘤和乳腺癌类器官在标准 BME 中的相似的增殖、形态学特征、基因表达和药物反应；此外，EKGel在机械性能和稳定性方面表现优异，可适用于微流控类器官芯片。Hogstrom等［13］为探究基质细胞在内分泌治疗耐药中的作用，重新优化了类器官模型的培养条件，该优化方案可长期培养对激素治疗有反应的 HR+PDOs。而不同于上述研究团队针对类器官的培养液进行优化，Dekkers等［14］利用患者来源的乳腺组织培养类器官，通过成簇的规律间隔的短回文重复序列-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，RISPR/Cas9）系统敲除了肿瘤蛋白P53、磷酸酶及张力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN）、视网膜母细胞瘤基因1（retinoblastoma gene，RB1）和神经纤维瘤病1型基因（neurofibromatosis Type 1，NF1）这4个乳腺癌相关的抑癌基因，成功培养出可多次传代且对内分泌治疗或化疗敏感的乳腺癌类器官。
乳腺癌类器官的应用
乳腺癌发病影响因素及机制研究
虽然传统的细胞系模型具有容易处理、培养和维护的特点，且有丰富的历史数据为研究提供参考，但PDXs和类器官因其具备维持遗传和表型异质性、3D 结构以及PDXs的肿瘤-基质相互作用的特性，在研究疾病发展因素中更显优势，它能更准确地再现体内生长条件，这对于理解癌症发展的复杂性至关重要。Chew 等［15］通过整合基因测序、RNA分析和人类乳腺癌类器官模型试验，确定了异常 FGFR 信号作为特定乳腺癌亚型的潜在治疗靶点，且FGFR2-SKI融合基因对FGFR1-3抑制剂AZD4547具有显著的敏感性，提示其很可能是一个新发现的致癌基因。这些研究为开发个性化的乳腺癌治疗提供了有价值的见解，同时为未来的临床试验提供了理论基础。Vandervorst 等［16］利用类器官模型探究平面细胞极性（Wnt/ planar cell polarity，WNT/PCP）通路中作为关键分子的 VANGL 平面细胞极性蛋白 2（VANGL planar cell polarity protein 2，VANGL2）对乳腺癌细胞运动、细胞侵袭和乳腺癌转移的影响，验证了Vangl2在不同分子亚型的乳腺癌细胞中对细胞迁移发挥着重要作用，其中的类器官侵袭试验在评估肿瘤细胞的侵袭能力和转移潜力中相当关键，这种实验方法可以模拟肿瘤细胞在体内侵袭和转移的过程，通过观察和计量肿瘤细胞在3D环境中的侵袭能力，能更好地理解肿瘤的侵袭过程，并为开发抗侵袭和转移治疗策略提供重要线索，该研究还提示VANGL似乎是通过调节 Ras 同源蛋白 A（ras homolog family member A， RhoA）来介导乳腺癌细胞发生迁移活动的，为乳腺癌的治疗提供了新的思路。
药物筛选和个体化治疗
来自乳腺癌患者肿瘤组织的类器官模型因保留了原始肿瘤的组织学和遗传特征，非常适合药物测试，这个培育过程包括从患者的肿瘤组织中提取癌细胞，同时在模拟肿瘤环境的3D基质中进行培养［17］。Guillen等［18］探讨了患者来源的异种移植物、器官模型在药物筛选和精准肿瘤学中的应用，不同于 Sachs等［11］主要收集原发的、未经治疗的乳腺癌建立类器官模型，Guillen团队重点关注内分泌抵抗、难治性和转移性乳腺癌，他们发现稳定的基于PDXs的药物筛选是可行且更具效益的，并且可以在匹配的 PDXs 模型中验证结果。Jiang等［19］使用患者来源的组织器官模型研究长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA） DDIT4-AS1在TNBC 化疗敏感性中的作用，发现 lncRNA DDIT4-AS1 介导的自噬活化促进了TNBC的发展和化疗耐药性，提示针对DDIT4-AS1的治疗策略具有增强化疗对 TNBC 疗效的潜力，这些发现为开发针对TNBC的新型治疗方法提供了新的思路和方向。Soosainathan 等［20］在研究中使用了多种内分泌治疗耐药的乳腺癌细胞系模型，这些模型显示，转录相关的周期依赖性激酶 9（Cyclin-dependent kinase 9，CDK9）在对内分泌治疗和 CDK4/6 抑制剂帕博西尼的耐药性中起着重要作用；当 CDK9 抑制剂 AZD4573 与帕博西尼和氟维司群联合治疗可使PDXs中的肿瘤消退，这种联合治疗策略展示了克服内分泌治疗和CDK4/6抑制剂在雌激素受体阳性乳腺癌中的耐药性的潜力，为针对耐药性疾病的药物疗效机制研究提供了新的方向。 Saeki等［21］通过实验证实了乳腺癌PDOs中存在转录组肿瘤内异质性，通过绘制这些器官模型的转录组图谱，可以更深入地了解不同个体的肿瘤生物学特征。由于这些类器官模型与患者的肿瘤非常相似，它们可以为特定患者提供个性化的方案，以确定哪些药物最有可能有效［22］。随着PDOs越来越多地用于药物敏感性测定，癌症治疗的准确性也在逐步提高，它们除了被用于药物筛选、探索治疗候选物的细胞毒性和实现个性化治疗外，还被用于预测患者对免疫疗法如程序性细胞死亡蛋白 1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡配体1 （programmed death-ligand 1，PD-L1）抑制剂的反应，同时在共培养系统中评估免疫抑制功能，突显了PDOs在指导临床治疗和改善癌症治疗预后方面的潜力［23］。Shu等［24］将类器官药物敏感性数据与患者的临床结果相匹配，同时概述了TNBC 患者的临床反应与组织源性类器官对新辅助化疗（多西紫杉醇、 表柔比星）反应的一致性。Dong等［25］从美国国家癌症研究所多样性集Ⅳ化合物库中筛选出了一种小分子NSC260594，通过小鼠模型和类器官模型验证，该研究团队发现其在多种TNBC细胞中均表现出显著的细胞毒性，通过下调 Wnt 信号通路蛋白 Mcl-1 的表达来抑制肿瘤生长，为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的途径。因肿瘤异质性可能会显著影响治疗效果，故能提供患者特异性模型的个体化治疗方案在癌症研究中尤为重要，如利用患者来源的组织样本培养类器官研究疾病和测试治疗方法。相比细胞系模型，类器官可以保持较长时间培养，使研究人员能 够研究较为长期的过程，包括疾病进展和慢性治疗的影响。类器官系统的开发使得在体外研究不同器官之间的复杂相互作用成为可能，为系统效应提供了更全面的理解。并不是所有的乳腺癌都可作为PDXs移植，故利用类器官模型进行精准医疗并不是在任何情况下都可行，而那些已经发生转移的肿瘤，更需要更精准的个体化治疗。Yang 等［26］证实了间皮素（mesoothelin，MSLN）介导自然杀伤细胞 （natural killer cell，NK）在体外、体内和离体中对 TNBC 细胞具有高效杀伤作用，MSLN-NK可能是 TNBC患者的一种很有前途的治疗选择。Song等［27］在探究编码蛋白质的circRNA在TNBC 的病因和致癌原理中的作用时，发现circCAPG的敲除能显著抑制TNBC类器官的生长。Narayan等［28］研究发现，在177例接受肿瘤组织检测的患者中有56%在血浆样本中发现了磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚 基α（Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PI3KCA）突变，该研究团队利用ER-阳性乳腺癌类器官和具有PIK3CA突变的鼠源性异位乳腺肿瘤模型，证明磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）抑制剂 Alpelisib 与 fulvestrant 联合使用在绝经后女性和 HR 阳性、HER2阴性、PIK3CA突变型或进展性/转移性乳腺癌患者中均具有疗效。Campaner 等［17］报道了机械信号和 yes 相关蛋白 1（Yes-associated protein 1，YAP）激活抑制剂可以恢复耐药肿瘤类器官的化学敏感性。Yang 等[29］系统分析了 TNBC 中 RNA 剪接的变化，利用患者来源的类器官验证了具有胶原结构的肿瘤特异性剪接变体——巨噬细胞受体与胶原结构（macrophage receptor with collagenous structure， MARCO-TST）与不良预后相关，从而影响肿瘤生长和转移的理论。
与高通量筛选结合
高通量筛选是一种用于药物筛选的方法，可以快速评估大量化学物质或生物物质作为候选药物的潜力，这个过程涉及自动化、微型化试验和大规模数据的分析，在识别调节特定生物分子途径的活性化合物、抗体或基因方面起到至关重要的作用。Tsai等［30］对来自接受化疗治疗的乳腺癌患者培养的类器官进行功能蛋白质组学筛选，识别了关键分子靶点，确定核受体辅因子2 （nuclear receptor co-repressor 2，NCOR2）组蛋白脱乙酰酶是细胞毒性应激反应和抗肿瘤免疫的抑制剂。利用类器官对真实组织结构和功能的高度模拟，将高通量筛选与类器官技术相结合体现了药物筛选和个性化治疗的重要进展。基因组测试已成为个性化癌症治疗的主流，但由于像乳腺癌这样的癌症的分子异质性，其效果往往有限。Guillen 等［18］研究表明，使用PDOs进行功能测试可能比单独使用基因组学具有明显优势，高通量筛选和类器官的结合加速了药物研发过程，与传统的2D细胞培养相比，其有可能缩短将新药推向市场的时间。
小结与展望
几十年来，临床前的乳腺癌研究一直依赖细胞系模型和人源性肿瘤异种移植模型，虽然乳腺癌细胞系可以进行高通量筛查，但并不能完全捕获乳腺癌谱，并且缺少与个别患者的临床相关性，而人源性肿瘤异种移植模型又存在不能很好地模拟人类免疫系统的复杂性的问题。相比之下，类器官模型的建立能很好地模拟肿瘤的异质性，包括肿瘤微环境、免疫反应等，这有助于更准确地预测患者的响应和治疗效果，且可以在药物进入体内前进行药物筛选，从而减少临床试验的时间和成本。可尽管如此，类器官的局限之处仍然存在，对比常规细胞2D培养，乳腺癌类器官模型建立复杂度高，需要大量的细胞和材料，建立过程相对耗时。类器官无法完全模拟所有生理过程，如肿瘤的生长、扩散等。类器官模型是基于已有的肿瘤数据建立的，因此可能存在一定的偏差，这不单是乳腺癌类器官模型的培养问题，更是各种肿瘤类器官培养都存在的局限性。总的来说，类器官的研究是一个不断探索和进步的过程，随着技术的不断创新和研究的深入，期待类器官研究未来能够为人类健康保障带来更多的突破和贡献。
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