近30年来，结直肠癌流行病学、病因学、分子生物学以及临床诊疗方面的研究不断取得重要突破。但与此同时，结直肠癌的防治形势仍十分严峻：目前全球每年约有180万新诊断结直肠癌病例，结直肠癌是全球第三大最常见癌症；尽管早期结直肠癌可得到有效治疗，但结直肠癌仍然是癌症相关死亡的第二大原因，2018年约有90万人死于结直肠癌。
通过筛查手段尽早发现早期癌症或癌前病变，可极大增加结直肠癌成功治疗或治愈的机会。然而，目前广泛应用的结直肠癌筛查策略均存在一定的不足：粪便免疫化学检测（FIT）特异性相对较低，大量假阳性结果的出现可引起相当多不必要的结肠镜检查，且FIT在识别结直肠腺瘤（即癌前病变）方面的敏感性也比较有限；结肠镜检查具有侵入性且不够便捷（需要肠道准备、饮食限制），可及性也较低。目前迫切需要一种成本效益高的非侵入性结直肠癌筛查方法来最大限度地提高检测准确率。
2023年5月30日，消化道领域著名期刊Gastroenterology发表了一项国际、多中心研究的重要分析结果。该研究结果表明，结直肠癌患者的粪便样本中存在多种差异化表达的miRNA。由5种miRNA（包括miR-607-5p、miR-6777-5p、miR-4488、miR-149-3p和miR-1246）组成的标志物组合可有效筛查出结直肠癌或结直肠腺瘤患者。
研究共同第一作者为意大利基因组医学研究所的Barbara Pardini、Sonia Tarallo教授，意大利都灵大学的Giulio Ferrero教授；共同资深作者为意大利都灵大学的Giulio Ferrero教授、意大利基因组医学研究所的Alessio Naccarati教授；通讯作者为Alessio Naccarati和Barbara Pardini教授。
文章概要
截图来源：Gastroenterology
论文指出，越来越多的研究显示，小非编码RNA（sncRNA，如微小RNA[miRNA]）的失调与结直肠癌的发生发展密切相关。结直肠癌或癌前病变细胞分泌的miRNA可直接、持续地释放到肠腔中，这部分异常表达的miRNA被认为结直肠癌早期诊断和预后评估的潜在生物标志物。值得一提的是，miRNA在进化上高度保守，不容易降解，能顺利进入粪便并长期滞留。因此，粪便miRNA或可作为早期临床诊断及预后的新型结直肠癌生物标志物。
既往学术科研人员主要通过肿瘤组织或血液样本对miRNA表达谱进行全面分析，而在粪便样本中开展的miRNA分析通常仅限于小队列人群（未考虑群体统计学特征）。论文强调，不同的生活方式和饮食习惯可能会对miRNA水平造成显著影响。截至目前，不同粪便样本miRNA特征与结直肠癌患者临床病理表现（如特定结直肠癌分期、癌前病变或其他胃肠道疾病）之间有何关联，相关研究证据仍然十分有限。
当前这项多中心研究旨在通过深度测序，在粪便样本中评估可以用于结直肠癌筛查（并区别结直肠腺瘤或其他胃肠道疾病）的miRNA标志物。分析共包含四个队列（意大利人群队列、捷克人群队列、验证队列和FIT队列），这4个队列的受试者情况如下：
意大利人群队列：共包含317例受试者粪便样本，包括89例散发性结直肠癌、74例结直肠息肉（6例增生息肉、20例非晚期腺瘤、48例晚期腺瘤）、49例胃肠道疾病、105例结肠镜检查阴性对照；
捷克人群队列：共包含162例受试者粪便样本，包括66例结直肠癌、28例结直肠息肉（9例增生息肉、13例非晚期腺瘤、6例晚期腺瘤）、32例其他胃肠道疾病、36例结肠镜检查阴性对照；
验证队列：共包含141例结直肠癌患者粪便样本以及80例健康志愿者粪便样本；
FIT队列：包含结直肠癌筛查中采集的185例检测结果为阳性的FIT缓冲液剩余样本（包括53例对照样本、80例晚期腺瘤、30例非晚期腺瘤、22例结直肠癌）。
研究人员首先通过小RNA测序的方法在意大利人群和捷克人群队列（155例结直肠癌、87例晚期腺瘤、96例其他胃肠道疾病、141例结肠镜检查阴性对照）的粪便样本分析了miRNA的表达特征。随后，他们通过机器学习的方法确定了可用于结直肠癌筛查的预测性miRNA标志物，并在验证队列粪便样本中进行了测试。
结直肠癌患者的粪便miRNA特征
分析结果显示，两项欧洲人群队列（意大利人群队列、捷克人群队列）中，结直肠癌患者和对照受试者共有25种miRNA存在显著差异化表达（20种呈现上调表达趋势，5种呈现下调表达趋势；P < 0.001）。校正影响因素（队列、年龄、性别、BMI和吸烟习惯）后的分析结果显示，这25种差异化表达的miRNA中有22种仍然与结直肠癌显著相关（P < 0.05）。
结合结直肠癌患者的临床数据，进一步的分析结果表明，3种呈现下调表达趋势miRNA（miR-607-5p、miR-677-5p、miR-922-5p）的水平随着肿瘤体积的增加而显著下降。此外，在疾病分期较晚或伴有淋巴结浸润的患者中，miR-922-5p的表达水平也呈现显著下降。
与此相对的是，19种呈现上调表达趋势miRNA的水平随着肿瘤体积的增加而升高（其中miR-1246、miR-1290、miR-148-3p、miR-194-5p最为显著）。在伴有淋巴结浸润的患者中，11中呈现上调表达趋势miRNA的表达水平显著升高。此外，与结肠癌相比，直肠癌患者样本中这11种miRNA的水平显著更高。
功能性分析的结果显示，这些差异化表达的miRNA涉及癌症相关过程（包括细胞周期调控和DNA修复）。
结直肠癌筛查最佳miRNA组合
研究人员通过机器学习的方法分析了可有效筛查结直肠癌的最小数量（即在保留较高区分效力的同时排除具有潜在分子关联的miRNA）的miRNA标志物组合。结果显示，由5种miRNA（miR-607-5p、miR-6777-5p、miR-4488、miR-149-3p和miR-1246）组成的最佳标志物组合可有效区分结直肠癌患者和对照受试者（曲线下面积[AUC]=0.86；95%CI 0.79~0.94）。此外，独立验证队列的分析结果（AUC=0.96；95%CI 0.92~1.00）也同样支持这一发现。
值得一提的是，这5种miRNA组合还能准确的区分Ⅲ~Ⅳ期结直肠癌患者与对照受试者（验证队列AUC为0.96），或Ⅰ~Ⅱ期结直肠癌患者与对照受试者（验证队列AUC为0.95）。
结直肠腺瘤、其他胃肠道疾病miRNA特征
研究人员结合132例结直肠癌患者样本（102例患者的肿瘤组织和匹配癌旁组织；30例患者的腺瘤组织和匹配腺瘤旁组织）、210例血浆细胞外囊泡样本、185例FIT队列剩余样本，对不同样本中的miRNA表达特征进行了比较。
分析结果显示：
1. 结直肠癌组织和匹配癌旁组织中，有14种存在显著差异化表达的miRNA。其中，粪便样本中7种呈现上调表达趋势的miRNA，有3种已经被纳入miRNA组合（分别为miR-1246、miR-4488和miR-149-3p）。腺瘤组织和匹配腺瘤旁组织的分析结果显示，相较于瘤旁组织，腺瘤组织中miR-21-5p、miR-1290、miR-148a-3p和miR-200b-3p呈显著上调趋势（P < 0.001），而let-7i-5p和miR-4508呈下调趋势。
2.最佳标志物组合中的miR-6777-5p在任何其他类型的胃肠道疾病中均不存在显著差异化的表达（与对照受试者相比）。此外，miR-149-3p仅在结直肠腺瘤者中显著上调；miR-607-5p仅在结直肠腺瘤或溃疡性结肠炎患者中显著下调；miR-4488和miR-1246在憩室病、溃疡性结肠炎、憩室炎或结直肠腺瘤患者粪便中水平显著升高；miR-1246在克罗恩病患者粪便中水平也显著升高。
3. 最佳标志物组合可用于区分结直肠腺瘤和对照组受试者（AUC=0.82）、结直肠腺瘤和非结直肠腺瘤患者（AUC=0.80）、结直肠癌或结直肠腺瘤患者与对照组受试者（AUC=0.84）。
4. FIT缓冲液剩余样本中的miRNA特征与预保存缓冲液中的miRNA特征具有良好的相关性，结直肠癌或结直肠腺瘤患者样本中依然存在相应miRNA水平变化特征。
小结
当前这项研究为“首个对粪便miRNA特征进行大规模分析的研究”。研究对结直肠癌、结直肠息肉、其他胃肠道疾病患者以及对照受试者的粪便样本进行了深度测序。
综合多个研究队列的分析结果，当前这项研究证实粪便miRNA或可作为非侵入性筛查的有效标志物。值得注意的是，一种miRNA标志物组合（由5种miRNA组成）能准确区分结直肠癌患者和对照受试者、癌前病变患者和对照受试者，且该标志物组合在结直肠癌患者FIT缓冲液剩余样本中依然稳定存在。未来，我们应继续开展进一步研究来证实这种标志物组合在结直肠癌筛查中的应用价值。
Barbara Pardini et al, A Fecal MicroRNA Signature by Small RNA Sequencing Accurately Distinguishes Colorectal Cancers: Results From a Multicenter Study. Gastroenterology (2023). DOI: 10.1053/j.gastro.2023.05.037
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