过继细胞疗法（ACTs）出现至今已有几十年时间，CAR-T细胞的成功更是革新了ACTs治疗领域，但同时也清楚的显现出其局限性。未来的肿瘤治疗如要更好的发挥ACTs作用，就要对其存在的问题有着深刻的认识和分析，并积极探索解决方法。近期，中国科学院深圳先进技术研究院学者发表于《血液学与肿瘤学杂志》（Journal of Hematology & Oncology）的一项综述，详细描述了ACT领域药物的发展、优势和可能面临的挑战以及解决方法，并概述了基因转染策略在免疫细胞工程中的重要性以及存在的问题和解决方法。【肿瘤资讯】整理如下，以下读者。
往期回顾：
（一）TIL与TCR ‐ T篇：过继细胞疗法——新技术与新挑战
（二）CAR-T篇：过继细胞疗法——新技术与新挑战
CAR-NK：强大的天然抗肿瘤作用
NK细胞约占外周血淋巴细胞的15%，它能区分自身和非自身信号，无需递呈直接杀死异常细胞，分泌大量细胞因子和化学因子，通过与巨噬细胞和树突状细胞（DC）相互作用发挥免疫调节作用，这些特点使得NK细胞具备了成为肿瘤免疫治疗重要工具的基本条件，CAR-NK细胞有望成为实体瘤治疗的有效方法。
优势
1.通用潜能
NK细胞的一致性、低免疫原性、较少需要MHC匹配以及较低的GvHD风险，使得使用异基因NK细胞并作为通用型细胞成为可能，同时解决了制造时间长、质量不稳定的缺点，降低了费用，而且异基因NK细胞不受肿瘤细胞MHC影响，使其更适合免疫治疗，目前已有研究证实了异基因CAR-NK细胞的疗效和安全性。NKs的来源主要有三部分：（１）外周血（PB）和脐血（UCB），UCB中NK细胞丰富，更具可行性；（2）人胚胎干细胞（hESCs）或诱导的多能干细胞（iPSCs），经分化后产生NK细胞；（3）细胞系，通过照射去除其肿瘤性，仍保留其治疗作用，可显著降低费用。
2. 安全性
NK细胞不分泌可导致CRS的IL-1和IL-6，研究证实CAR-NK细胞与CRS和NT无关，此外半衰期短也是其更安全的原因之一。
3.细胞毒作用
CAR-NK细胞具有更多攻击肿瘤细胞的方法（图5B）：（1）通过分泌颗粒酶和穿孔素直接溶解肿瘤细胞，还可分泌细胞因子和化学因子招募其他免疫细胞杀伤肿瘤细胞；（2）NK细胞本身并不表达PD-1，但可从肿瘤细胞获得PD-1而影响其功能，因此NK细胞对PD-1阴性肿瘤细胞的杀伤作用优于T细胞；（3）NK细胞表达Fc受体，是介导ADCC作用最强的细胞之一，因此与抗体药物联合可能会产生更强大的治疗作用；（4）除了依赖CAR杀伤靶细胞，NK细胞本身即具有细胞毒作用，能杀伤低抗原密度肿瘤细胞，减少复发，同时也可能是毒性的潜在因素。
研究进展
CAR-NK细胞研究仍处于早期阶段，在血液肿瘤和实体瘤中均有尝试，前者靶向的抗原主要有CD19、CD33、BCMA和CD22，后者主要有NKG2D配体、PD-L1、ROBO1和5T4。现有结果显示异基因CAR-NK细胞有效且安全，具有临床应用的可行性。
挑战和潜在解决方案
1.体内持久性差
半衰期短且扩增能力差，使得CAR-NK细胞体内持久差，影响治疗作用。通过增加NK细胞活性或是增加靶细胞活化配体的表达，可代偿持久性差的缺点；IL-2、IL-15和IFN-γ有促进NK细胞增殖作用，但需注意副作用和易耗竭的问题。
2.浸润能力差
CAR-NK细胞同样存在实体瘤浸润能力差的问题，增加CAR-NK细胞趋化能力、与OVs联合应用或是局部使用CAR-NK细胞有助于改善其浸润能力。
3.数量不充足
患者自身PB中NK细胞数量有限，异基因NK细胞可作为制造CAR-NK细胞的主要来源，但要完全与T细胞分离才能防止GvHD；UCB中NK细胞具有更好的增殖能力，初步研究结果也极具前景，但PB和UCB来源NK细胞因供者不同而有较强异质性，hESCc和iPSCs来源NK细胞虽具一致性，但耗时长，有肿瘤原性风险；NK细胞系虽有快速无限的增殖能力、细胞一致性好、费用低等优点，但使用前需照射去除肿瘤原性，会显著影响治疗能力，而且有些NK细胞系不表达CD16，无法介导ADCC所致细胞死亡。
4.NK细胞的最优CAR仍需探讨
目前CAR-NK细胞使用的CAR结构几乎完全照搬CAR-T细胞，而4-1BB在NK细胞中的作用尚有争议，因此需要遵循NK细胞本身特点，设计能更好发挥NK细胞治疗作用的CAR结构。
5.基因转染面临挑战
NK细胞的转导效率远低于T细胞，慢病毒载体转染效率不足20%；逆转录病毒载体转染效率虽优于慢病毒，但有插入突变风险；mRNA电穿孔有较高的转染效率，但其表达不完整且短暂，需要多次输注，增加工作量同时还要耗费大量NK细胞；其他转染方法缺少在NK细胞中的实际经验。
6.冻融敏感
NK细胞对冻融过程极为敏感，复苏可致其生存和细胞毒作用明显下降，加入IL-2可部分恢复NK细胞活性，进一步改善NK细胞对冻融的耐受性具有实践意义。
CAR-巨噬细胞（M）：未来的实体瘤“杀手”
巨噬细胞在吞噬、分泌细胞因子、抗原递呈方面具有重要作用，是固有免疫的重要组成，也是联接固有免疫和适应性免疫的中枢。巨噬细胞高度可塑，形成功能完全相反的M1和M2亚群，M1有促炎和抗肿瘤作用，M2则抑制免疫反应、促进血管生成。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）为M2表型，对肿瘤生长转移具有关键作用，因此也成为很有前景的治疗靶点。肿瘤组织中的TAMs高达50%，并很容易进入肿瘤内部，是浸润最多的免疫细胞。巨噬细胞的CAR包括胞外识别区、穿膜区和胞内信号区（图６A），胞内信号区最常使用的是CD3、CD147、Megf10和FcR，2018年首个CAR-M诞生，并证实其具有靶向吞噬和去除癌细胞的作用。
图6 CAR-M细胞的CAR结构和抗肿瘤模式
优势
1.改善TME作用
巨噬细胞对TME具有调节作用：与周围的免疫细胞相互作用，增加对靶细胞的吞噬作用（图6C）；通过抗原递呈向其他免疫细胞传递信息，调动其他免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力；诱导M2向M1转化、分泌炎症因子。
2.强大的浸润能力
巨噬细胞是肿瘤组织中最常见的免疫细胞，因其可分泌能够降解ECM的酶，同时巨噬细胞还有促进其他免疫细胞浸润的作用（图6B）。
3.安全性
半衰期短、异基因巨噬细胞无GvHD风险以及缺少致死性CRS，这些使得CAR-M的安全性超过了其他CAR-细胞。
4，强大的通用性
无GvHD风险，使得异基因巨噬细胞可用于制造通用型CAR-M细胞，有研究显示iPSCs也可作为CAR-M细胞来源。
5.多种杀伤模式
CAR-M的杀伤模式多样：抗原特异性吞噬作用、抗原非依赖性吞噬作用、抗原递呈促进其他免疫细胞的杀伤作用以及对高度异质性肿瘤细胞的杀伤。这些作用有利于完全去除肿瘤细胞，预防复发。
研究进展
目前Clinicaltrials.gov上只有二项CAR-M研究注册，CT-0508（靶向HER-2、Ad5f35转染的iPSCs）是首个用于人类研究的CAR-M治疗，另一项CAR-M研究仍处于临床前阶段。
挑战和潜在解决方案
1.CAR-M的高度可变性
巨噬细胞高度可变的特性，使得其在复杂的体内环境中具有不可控制性，支持CAR-M体内安全性和疗效的数据非常有限，目前有关保证CAR-M抗肿瘤表型的研究较多。
2.数量不充足
CAR-M治疗需要大量巨噬细胞，但PB中此类细胞数量有限，且无论体内外均不能继续增殖。异基因巨噬细胞较少导致GvHD，可作为细胞来源，iPSCs也是较好的细胞来源，但要关注其肿瘤原性。
3.基因转染困难
巨噬细胞对病毒具有天然的拮抗作用，因此常规病毒转染异常困难，而且巨噬细胞高度可塑，故基因转染时要注意避免影响其表型。已证实腺病毒载体Ad5F35可用于CAR-M转染，此外纳米生物技术有望为制造CAR-M提供更便利的方法。
4.潜在毒性
迁移特征会严重影响CAR-M的治疗作用，表达特定细胞因子受体驱动CAR-M向肿瘤迁移可克服这一缺陷，此外局部注射也可避免这一问题。
5.巨噬细胞CAR仍需进一步优化
虽然CD3ζ CAR-M可促进特异性吞噬、产生炎症性细胞因子、具有抗原递呈作用，但其改进空间仍然巨大。
CAR-γδT：异基因细胞治疗的最佳候选
γδT细胞具有不同于αβT细胞的特点，可能会赋予CAR-T细胞新的作用。γδT细胞参与固有免疫和适应性免疫，能快速识别非MHC限制性肿瘤抗原，研究显示肿瘤浸润γδT细胞与良好预后相关。首个CAR-γδT细胞诞生于2004年，并证实具有抗肿瘤作用潜能。
优势
1.多种杀伤模式
CAR-γδT细胞杀伤肿瘤细胞可通过CAR介导的细胞毒作用，还可通过其固有的受体Vδ1TCR、CD16、NKG2D和NKp30活化其他肿瘤杀伤途径，如穿孔素/粒酶依赖细胞毒作用、CD16介导的ADCC和TRAIL/FASL介导的凋亡（图7A），此外γδT细胞也可递呈抗原。
2.通用
γδT细胞为MHC非依赖性，故不会导致GvHD，此点非常适合通用型CAR-T细胞的制造。体内研究显示异基因CAR-γδT细胞安全性良好。
3.浸润能力强且对低氧耐受
γδT细胞的归巢作用优于αβT细胞，三个亚型Vδ1、Vδ2和Vδ3中以Vδ1尤其突出，因此肿瘤浸润能力更好，尤其是低氧TME时，而且低氧时γδT细胞的细胞毒作用和分泌MIP1、RANTES和CD40L的能力更强。
4.改善TME
活化的γδT细胞可分泌多种炎症性细胞因子和化学因子，形成炎症性微环境（图7A）；γδT细胞是固有免疫和适应性免疫的桥梁，具有促进DC成熟，活化NK细胞，促进B细胞产生抗体，改善体液免疫应答的作用；γδT细胞还可作为APCs，动员旁观者免疫细胞攻击肿瘤细胞（图7A）。
图7 CAR-γδT和CAR-NK细胞治疗的抗肿瘤模式
研究进展
临床前研究中CAR-δT细胞表现良好，但临床数据很少，且局限于血液系统肿瘤。ADI-001，CD20 CAR-δT细胞治疗非霍奇金B细胞淋巴瘤的I期结果促使FDA批准其进入快速通道。
挑战和潜在解决方案
1.数量不充足
成人患者每次约需输注108个细胞，PB中γδT细胞非常有限，而体外扩增γδT细胞很困难，因此目前的临床前研究主要集中于如何有效扩增γδT细胞。
2.CAR仍需更佳优化
CAR-γδT细胞的安全性更好，但仍需注意靶向非肿瘤效应，Anderson等设计了一个包含抗GD2 scFv连接DAP10胞内区的CAR，与Vγ9Vδ2 TCR协同能充分活化CAR-γδT细胞，并能更精准的杀伤肿瘤细胞。如何预防肿瘤免疫逃逸、减少γδT细胞耗竭、改善并维持γδT细胞的体内持久性，这些问题均有待改善，CAR-γδT细胞在实体瘤中的作用以及与免疫抑制性TME的相互影响，也有待进一步明确。
CAR-NKT：实体瘤治疗的新选择
NKT细胞是固有免疫T细胞，在胸腺中发育后具有了NK细胞特征，因此同时具有NK和T细胞受体，拥有特异和非特异杀伤功能，可分泌多种细胞因子和化学因子以及通过相互作用影响多种免疫过程。NKT细胞的直接杀伤作用依赖于CD1d糖脂递呈至TCR，然而多数肿瘤CD1d阴性，NKT细胞不能直接杀伤，CAR结构可补偿这一不足，现有研究显示，CAR-NKT细胞具有可行性。
优势
1.安全性
与传统CAR-T细胞相比，CAR-NKT细胞并不导致过度的免疫反应，临床研究也显示CAR-NKT细胞并不导致严重的CRS和NT。
2.多种杀伤模式
CAR-NKT细胞具有多种杀伤肿瘤细胞的方式（图7B）：CAR介导的靶向杀伤；非靶依赖性的直接杀伤；CD1d CAR可进一步加强直接杀伤作用；能够穿透血脑屏障。
3.改善TME
CAR-NKT细胞能招募并活化其他免疫细胞，抑制TAMs，对CD1d+M2细胞具有杀伤作用，因此有改善TME的作用。
4.通用性
NKT细胞不诱导GvHD，因此适合制造通用型CAR-NKT细胞。
研究进展
迄今只有五项CAR-NKT细胞的临床研究，只有一项1期研究发表了中期数据，自体靶向GD2 CAR-NKT细胞治疗复发耐药神经母细胞瘤，3例中1例CR，骨转移退缩，无患者发生明显的副作用。
挑战和潜在解决方案
1.数量不充足
PB T淋巴细胞中NKT细胞只占0.1%~1%，体外扩增后可能会降低其作用。工程化HSC-iNKT（iNKT为I型NKT细胞[invariant natural killer T]）和iPSCs用于制造iNKT细胞正在研究中。
2.体内持续时短
CAR-NKT细胞需要多次输注才能保证其确切疗效，这无疑加剧了NKT细胞供应不足的问题，延长CAR-NKT细胞的体内持久性有助于缓解这一问题，CD62L+NKT细胞正在尝试中。
Zhang P, Zhang G, Wan X. Challenges and new technologies in adoptive cell therapy. J Hematol Oncol. 2023;16(1):97. doi:10.1186/s13045-023-01492-8
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